Estudos estruturais e funcionais da enzima N5, N10 - metilenotetrahidrofolato-desidrogenase-ciclohidrolase de Xanthomonas albilineans aplicados à descoberta de candidatos a inibidores para o tratamento da escaldadura das folhas - Bueno, Renata Vieira (2018)
A escaldadura das folhas, causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas albilineans, é uma das doenças mais importantes que afetam o cultivo da cana-de-açúcar, causando significativa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda da qualidade do caldo extraído. O impacto dessa doença somado à ausência de agentes químicos ou biológicos para o controle estimula a pesquisa para a descoberta e desenvolvimento de moléculas bioativas como candidatos a novos defensivos agrícolas. Nesse contexto, a enzima N5, N10-metilenotetrahidrofolato desidrogenase ciclohidrolase (FolD) destaca-se como potencial alvo molecular. O projeto de doutoramento visou a caracterização estrutural e funcional da FolD de X. albilineans (XaFolD), além da triagem de moléculas candidatas a inibidores. Para tanto, foram conduzidos estudos integrados em biologia molecular estrutural e química biológica. A expressão heteróloga e purificação da XaFolD resultaram na produção de proteína funcional e adequada aos ensaios de cristalização. A caracterização das atividades desidrogenase e ciclohidrolase da XaFolD indicou os valores de KM para os substratos de ambas as reações, N5, N10-metileno-tetrahidrofolato (50 ± 10 µM) e N5, N10-metenil-tetrahidrofolato (32 ± 3 µM) e do cofator NADP+ (688 ± 81 µM). A estrutura da XaFolD na forma apo, elucidada a 2,1 Å de resolução, revelou uma proteína constituída por 11 hélices alfa e 9 fitas beta distribuídas em um domínio N-terminal catalítico e um domínio C-terminal de ligação ao dinucleotídeo. A enzima pura foi utilizada para a triagem de 1.124 fragmentos por interferometria de biocamada (BLI) e foram identificados três ligantes, DDD00808259 (KD = 260 μM), DDD01305586 (KD = 3 mM) e DDD00100784 (KD = 210 μM), com valores de afinidade na faixa do submilimolar até baixo milimolar. Paralelamente, uma abordagem computacional foi empregada para a triagem virtual de base de dados de compostos como candidatos a ligantes da XaFolD. Os critérios utilizados resultaram na seleção e aquisição de 31 compostos de diferentes classes químicas para avaliação da atividade inibitória frente a enzima alvo. Por fim, ensaios fenotípicos de triagem de inibidores resultaram na descoberta de compostos capazes de inibir o crescimento in vitro de X. albilineans. Dentre os inibidores identificados o composto THP2 apresentou a maior potência, com valor determinado de EC50 igual a 23 ± 2 μM. Os dados estruturais, cinéticos e biofísicos obtidos nesta tese de doutoramento formam a base experimental e computacional para a descoberta e planejamento de inibidores candidatos a novos agroquímicos para o tratamento da escaldadura das folhas.