Silenciamento gênico por RNA interferente (RNAi) em traça-do-tomateiro, Tuta absoluta (Meyrick): abordagens de entrega do dsRNA. - Souza, Larissa Costa de (2022)
A Traça-do-tomateiro, Tuta absoluta Meyrick 1917 (Lepidoptera: Gelechiidae), é uma das pragas de maior importância econômica do tomateiro. O inseto pode causar perdas de 80 a 100% na produção de tomate por meio do consumo dos tecidos do mesófilo foliar das plantas, causando redução da capacidade fotossintética e da biomassa vegetal. Devido ao uso repetitivo e excessivo de inseticidas sem a devida rotação dos princípios ativos, associado ao alto número de gerações da praga durante o ciclo do tomateiro, há o potencial surgimento de populações resistentes de T. absoluta aos inseticidas, sendo necessárias novas tecnologias para controle desta praga. O RNA interferente (RNAi) consiste em um mecanismo de silenciamento gênico que envolve o fornecimento de moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) homólogas a uma sequência específica de gene alvo essencial da praga que leva ao silenciamento da expressão deste. A entrega da tecnologia de RNAi em campo pode ser via geração de plantas que produzam o dsRNA via transgenia ou a produção de moléculas de dsRNA para aplicar diretamente na planta e no inseto como um inseticida, sendo necessário estudos para avaliar a forma eficiente de entrega de RNAi contra os insetos praga e seu potencial de controle. Com isso, neste estudo foi analisada a entrega de dsRNA para o controle de T. absoluta via plantas transgênicas e por dsRNA sintético absorvidos em folíolos de tomateiro destacados. Nas duas formas de entrega, foram utilizadas as mesmas regiões dos mesmos genes alvos, sendo o que codifica a subunidade A da ATPase vacuolar (V-ATPase A) e a Arginina quinase (AK). Na primeira etapa do trabalho foi possível otimizar um método de entrega das plantas de tomateiro cv. Micro-Tom para lagartas de T. absoluta, que permitiu uma avaliação precisa do dano foliar e permitiu o desenvolvimento normal do inseto. O método testou três densidades de lagartas expostas para se alimentar nos folíolos do tomateiro, e foi avaliado a área de lesão, duração e viabilidade das fases de lagarta, pupa e adulto. O melhor resultado obtido de acordo com os parâmetos avaliados foi o de densidade de 3 lagartas récem eclodidas, sendo colocada uma lagarta por foliolo, podendo mantê-las por 12 dias até completar seu ciclo larval normal, permitindo avaliar o dano foliar. Posteriormente, foram realizados ensaios com a entrega de tomateiro cv. Micro-Tom transgênicos empregando a metodologia anterior. Os eventos transgênicos foram selecionados após a confirmação da transgenia na geração de plantas T3 pela amplificação de fragemtno por reação em cadeia da polimerase (PCR) e pelo nível de expressão dos transgenes pela amplificação quantitativa de transcritos reverso (RT-qPCR). Entre os oito eventos V-ATPase-A e cinco AK, foram escolhidos quatro V-ATPase e três AK. Os ensaios de entrega dos eventos trangênicos permitiram detectar a diminuição significativa da herbivoria para os eventos AK3 e VATPase 4.1 e o silenciamento dos genes alvos da T. absoluta quando alimentadas dos eventos AK3 e VATPase 1.2. Para os ensaios conduzidos de entrega de moléculas de dsRNA sintéticas por meio em folíolos destacados de tomateiro cv. Santa Clara que absorveram o dsRNA via peciolo houve redução significativada herbivoria de T. absoluta nos folíolos tratados com 2 e 4 g de dsRNA com sequências do gene AK e nos tratamentos com 1 e 4 g de dsRNA com sequências do gene V-ATPase A em relação ao controle com água. Em conclusão, este trabalho desenvolveu uma metodologia eficiente para entrega de tomateiro cv. Micro-Tom e detectou a redução da herbivoria e silenciamento gênico de T. absoluta quando lagartas se alimentaram dos eventos transgênicos de RNAi para o gene AK e V-ATPase A. Também demonstrou menor herbivoria de T. absoluta com a entrega de dsRNA sintetizados in vitro para os genes alvos AK e V-ATPase A