Caracterização estrutural da Fábrica Viral de Mimivirus por meio de técnicas de Imageamento de Raios X Síncrotron - Delfino, Leonardo Martins (2025)
A presente dissertação investiga a organização estrutural de células de Acanthamoeba castellanii e suas interações com vírus gigantes, com ênfase no Niemeyer Vírus e dados preliminares do Tupanvirus, empregando abordagens de imageamento multitécnicas baseadas em radiação síncrotron. O trabalho teve como objetivos principais caracterizar a formação e a dinâmica das fábricas virais durante o ciclo replicativo desses vírus e desenvolver protocolos para a aplicação de técnicas avançadas de tomografia em amostras biológicas. Para tal, culturas clonais de A. castellanii foram estabelecidas, reduzindo a heterogeneidade dos ensaios, e submetidas a infecção controlada pelos vírus. As amostras foram preparadas para experimentos de Tomografia Computadorizada Ptychográfica de Raios X (PXCT), conduzidos na linha de luz Cateretê do síncrotron Sirius/ LNLS, e para Crio-Tomografia de Raios X Mole (Cryo-SXT), realizados na linha MISTRAL do síncrotron ALBA. Protocolos de fixação, vitrificação, secagem em ponto crítico e contrastação com tetróxido de ósmio foram otimizados para preservar a integridade estrutural celular. Os resultados mostraram que a PXCT possibilitou a reconstrução tridimensional de trofozoítos controles e infectados, revelando alterações morfológicas significativas associadas ao efeito citopático viral, incluindo redistribuição de vacúolos e mitocôndrias. A análise de Cryo-SXT, por sua vez, permitiu visualizar fábricas virais em estado quase nativo, evidenciando compartimentalização funcional entre regiões de replicação e montagem de vírions. Segmentações manuais e assistidas por inteligência artificial em softwares especializados (Avizo, Amira e Dragonfly) corroborara para essas observações, demonstrando o potencial das técnicas em destacar organelas e estruturas virais em volumes inteiros de células. A integração dos dois métodos revelou-se complementar, sendo a PXCT mais adequada para análises quantitativas em profundidade e a Cryo-SXT para visualização de estruturas nativas com alto contraste. Conclui-se que a combinação de abordagens baseadas em raios X coerentes e moles amplia as possibilidades de estudo da virologia estrutural, contribuindo para a compreensão da biologia dos vírus gigantes e para o desenvolvimento de novas metodologias em bioimagem tridimensional.