Estudo estrutural e funcional das proteínas spliceossomais U5-15K, U5-102K e Prp43 de Trypanosoma brucei - Lima, Ana Laura de (2020)
A Tripanossomíase Humana Africana (Human African Trypanosomiasis, HAT), popularmente conhecida como Doença do Sono, é causada por um protozoário extracelular pertencente ao gênero Trypanosoma presente no continente africano. Apesar dos avanços no controle e tratamento da doença, o estudo dos tripanossomatídeos é interessante, pois esses organismos possuem mecanismos bioquímicos únicos e conservados entre si como a transcrição policistrônica e processamento da maioria do seu pré-RNA mensageiro por trans-splicing, que podem ser usados de modelo para o estudo de outros tripanossomatídeos. O splicing é o processo de retirada de regiões não codificantes do gene dos eucariotos, chamadas de íntrons, e subsequente ligação das regiões codificantes, os éxos. O splicing pode ocorrer de duas formar cis-splicing e trans-splicing. Tanto no cis quanto no trans-splicing, as reações de transesterificação são catalisadas pelo spliceossomo, uma maquinaria dinâmica que se rearranja em cada passo da reação através da interação ordenada de cinco ribonucleoproteínas (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) denominadas U1, U2, U4/U6 e U5 e inúmeros fatores não snRNPs. Esses complexos são compostos de pequenos RNAs ricos em uridina (U snRNAs) ligados a proteínas específicas de cada snRNP e proteínas comuns a todas as snRNPs (proteínas Sm). Esse trabalho tem como objetivo o estudo de duas proteínas específicas de U5 snRNP, U5-102K e U5-15K, bem como de uma helicase relacionada à liberação dos produtos do splicing, a Prp43. A U5-102K é formada por 44 hélices-α sendo 36 organizadas nas repetições chamadas TRPs. Essa proteína é essencial para a formação do tri-snRNP U5.U4/U6. Já a U5-15K possui uma estrutura semelhante a de uma tiorredoxina e tem uma localização central no tri snRNP U5.U4/U6, participando da estabilização do U6 snRNA e sua saída do spliceossomo pode estar relacionada à ativação de um dos complexos formados na durante a reação. A Prp43 é uma proteína da família DEAH-box e participa dos passos finais do processo de splicing, atuando na liberação do íntron excisado. Esse trabalho teve como objetivo a caracterização da atividade de autoclivagem da U5-15K, o estudo de sua estrutura terciária, interação com a U5-102K e a identificação dos parceiros de interação da U5-102K e da Prp43. Foram realizadas mutações sítio dirigidas na sequência da U5-15K, na cisteína 66 e em 4 serinas do C-terminal e os resultados mostram que o resíduo catalítico da autoclivagem seja a Ser 126 e o ponto de clivagem a Ala 142 e sugerem que a atividade pode ocorrer quando a proteína faz parte do complexo B. Os testes de cristalização usando a U5-15K sem alça e a U5-15K S126A, resultaram em pequenos cristais para a segunda proteína. Para a interação entre U5-15K e U5-102K foi expresso o N-terminal da U5-102K, região onde a interação das duas proteínas ocorre em humanos e levedura, e sinais da interação foram vistos com uso da técnica de DLS. A purificação dos parceiros de interação da U5-102K não resultou em novas proteínas identificadas. Os experimentos com a Prp43 resultaram na identificação de uma proteína homóloga à NtrI, que em humanos e levedura, faz a ativação da atividade da Prp43.