Imobilização da lacase CotA em esponjas de poliuretano: síntese, caracterização e aplicações - Soares, Jéssica de Moura (2024)
A enzima lacase (EC 1.10.3.2) é uma oxidorredutase pertencente à família das enzimas de cobre azul. É uma enzima bem caracterizada e com reconhecida capacidade de operar em condições extremas de temperatura e pH e atividade na oxidação de uma ampla gama de substratos, incluindo compostos fenólicos e materiais lignocelulósicos. Isso a torna uma ferramenta valiosa para a biocatálise, bem como para o tratamento de efluentes industriais e águas residuais. A presente tese estuda a imobilização da lacase da bactéria Bacillus subtilis (CotA) em um suporte de poliuretano, visando sua aplicação em processos de biorremediação, como na degradação de corantes. A pesquisa teve como objetivos sintetizar um suporte capaz de manter a atividade enzimática da CotA, caracterizar as propriedades bioquímicas da enzima imobilizada, avaliar sua capacidade de reutilização e explorar sua eficácia na degradação de corantes. A CotA, expressa como proteína heteróloga em Escherichia coli BL21 Star, foi purificada e submetida a testes de atividade com o substrato ácido 2,2\'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), tanto na presença quanto na ausência de solventes orgânicos utilizados na síntese do suporte de poliuretano. A enzima foi inicialmente imobilizada em esponjas de poliuretano através do método de aprisionamento. O pH ótimo da CotA imobilizada foi 3,5 e a temperatura ótima 55 ºC, e 50% de atividade foi mantida após 25 minutos a 90 ºC. No entanto, a CotA imobilizada apresentou uma capacidade limitada de reuso, perdendo cerca de 50% da atividade após o primeiro ciclo, provavelmente devido à lixiviação da enzima. Para superar essas limitações, a estratégia de imobilização foi alterada com a adição de quitosana e glutaraldeído ao suporte, promovendo a imobilização covalente da enzima. Essa nova abordagem resultou em esponjas com maior atividade enzimática total, com aumento da temperatura ótima para 70 ºC. A estabilidade térmica também aumentou, com a manutenção de mais de 40% de atividade após 60 minutos a 90 ºC e uma estabilidade mais duradoura na temperatura de 65ºC, mantendo 75% da atividade após 4 horas. Além disso, mais de 50% da atividade foi mantida nas esponjas após 10 ciclos de reuso. Ainda, houve uma alta estabilidade de armazenamento, com retenção de mais de 90% da atividade após 30 dias em tampão a 4 ºC e também com a possibilidade de armazenamento das esponjas secas. Esponjas contendo CotA imobilizada covalentemente também foram aplicadas na descoloração dos corantes fenólicos Azul de Bromofenol e Vermelho de Fenol. As esponjas contendo enzima alcançaram uma remoção de 85% do corante, enquanto que a mesma quantidade de enzima livre promoveu uma descoloração de 25%. Conclui-se que as esponjas de poliuretano desenvolvidas são um suporte adequado para a imobilização da lacase CotA, e que a imobilização covalente, possibilitada pela adição de quitosana e o tratamento com glutaraldeído, ofereceu vantagens significativas em termos de estabilidade enzimática, operacional e de armazenamento.