Estudo do proteoma de folhas de cultivares e genótipos de cana-de-açúcar - Kitano, Eduardo Shigueo (2017)
A cana-de-açúcar, uma das maiores culturas agrícolas no mundo, é uma antiga fonte de energia para os seres humanos e mais recentemente, tem sido utilizada como fonte para a produção de etanol. Em estudos moleculares sobre a cana-de-açúcar, sua complexidade genética e o fato de seu genoma não estar completamente sequenciado, dificultam a análise dos proteomas de seus diferentes tecidos. Recentemente, em um estudo de um grupo brasileiro sobre os transcriptomas de vários tecidos de cana-de-açúcar, 17.563 transcritos completos foram sequenciados, os quais correspondem a aproximadamente 53% do genoma predito desta planta. Entretanto, sabe-se que o conteúdo de mRNA nem sempre se correlaciona diretamente com os níveis de expressão de proteínas. Dessa forma, a caracterização do proteoma é importante para identificar as proteínas que são de fato expressas, em complementaridade aos estudos sobre o genoma, e fornece informação preditiva sobre a composição do proteoma de diferentes cultivares. Entretanto, estudos sobre folhas de cana-de-açúcar são raros. Neste estudo, com o objetivo de caracterizar o proteoma de folhas +1 de cana-de-açúcar, foram selecionadas duas espécies ancestrais (Saccharum officinarum [S. off] e S. spontaneum [S. sp]) e uma cultivar híbrida (SP80-3280 [SP]), as quais diferem-se na capacidade de produção de sacarose e na resistência a patógenos. A análise de parâmetros fisiológicos (taxa de fotossíntese, condutância estomática, taxa de transpiração e eficiência no uso de água), em folhas de 12 meses revelaram que em S. off e SP existe uma relação melhor entre o número de moléculas de água perdidas na transpiração e o número de moléculas de CO2 assimiladas na fotossíntese do que em S. sp. Os mesmos parâmetros foram avaliados em folhas +1 de SP com 4, 8, 11 e 13 meses de crescimento e revelaram o papel dos estômatos na manutenção do potencial hídrico das folhas, atuando na modulação da taxa de respiração em resposta às mudanças ambientais, entretanto sem induzir alterações drásticas na taxa de fotossíntese, no período avaliado neste estudo. Com o objetivo de obter proteínas em condições ótimas para análise proteômica, foram testados diferentes métodos de extração de proteínas, que foram avaliados quanto ao rendimento e perfil eletroforético das proteínas extraídas, e selecionado um protocolo que utiliza uma combinação de fenol e dodecil sulfato de sódio para este estudo. Para caracterizar e comparar os proteomas de folhas +1 de S. off, S. sp e SP, foram utilizadas as abordagens proteômicas Shotgun/bottom-up, GeLC-MS/MS e Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) (off-line e \"on-line\"), e as plataformas MaxQuant e Perseus, como ferramentas de bioinformática para análise dos dados. Os dados obtidos por meio destas abordagens foram combinados e resultaram na identificação de 5.825 grupos de proteínas em folhas +1 de S. off, S. sp e SP, e a análise de enriquecimento de termos pelo Gene Ontology destacou a natureza fotossintética desses proteomas, além da representatividade de organelas envolvidas em processos de fotossíntese e metabolismo de carbono. A análise quantitativa comparativa dos 1.060 grupos de proteínas identificados por meio da abordagem Shotgun/bottom-up revelou que 120 proteínas encontravam-se diferencialmente expressas em folhas de S. off, S. sp e SP, e destas, aquelas que mostraram diferença em abundância de pelo menos quatro vezes, são relacionadas com processos biológicos envolvidos com os estresses biótico e abiótico (resposta a outros organismos, resposta ao íon cádmio, defesa contra fungos e defesa ao estresse oxidativo). Para a análise da variação ontogenética no proteoma de folhas +1 de SP (de 4, 8, 11 e 13 meses de crescimento) foi aplicada a abordagem Shotgun/bottom-up, que resultou na identificação de 5.780 peptídeos, correspondendo a 1.615 grupos de proteínas únicos. Sessenta e cinco proteínas foram identificadas com abundância diferencial entre as amostras, e a análise de agrupamento hierárquico revelou que as folhas de 13 meses mostraram um perfil mais distinto, enquanto que as outras formaram um grupo separado. A caracterização dos fosfoproteomas de folhas +1 de S. off, S. sp e SP utilizando a abordagem Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) como método de enriquecimento de fosfopeptídeos, e identificação por LC-MS/MS, resultou na identificação de 633 fosfopeptídeos únicos em 515 proteínas. A caracterização dos fosfoproteomas de folhas +1 de SP (de 4, 8, 11 e 13 meses de crescimento) utilizando a abordagens IMAC e Hydroxy Acid-Modified Metal Oxide Chromatography (HAMMOC) como métodos de enriquecimento de fosfopetídeos, e identificação por LC-MS/MS, resultou na identificação de 558 fosfopeptídeos únicos em 413 proteínas. Em ambas análises, foram identificadas várias proteínas quinases fosforiladas, e de forma geral, a análise de enriquecimento de termos pelo Gene Ontology revelou o núcleo e o citoplasma, entre os componentes celulares, e a regulação da transcrição, a resposta ao estresse abiótico e a glicólise, entre os processos biológicos, como os termos mais enriquecidos. Este é o primeiro estudo objetivando a caracterização dos proteomas totais de folhas de cultivares e genótipos de cana-de-açúcar no Brasil, e seus resultados representam um significante esforço para o uso de diferentes abordagens de proteômica para aprofundar o conhecimento sobre os complexos processos fisiológicos que modulam o crescimento e a performance em cana-de-açúcar