Estudo comparativo da resposta imune do macrófago humano infectado com diferentes espécies do complexo Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium canettii - Silva, Felipe (2023)
A tuberculose (TB) é uma doença de humanos e animais causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC). Apesar da alta similaridade genética, patógenos do MTBC apresentam variações em predileção hospedeira e virulência. Aqueles adaptados aos humanos incluem Mycobacterium tuberculosis (M.tb), distribuído mundialmente, e Mycobacterium africanum L5 e L6, restritos ao oeste africano. Dentre espécies adaptadas aos animais, destacam-se Mycobacterium bovis e Mycobacterium caprae, principais causadores da TB bovina e zoonótica, capazes de infectar diversas espécies hospedeiras, incluindo humanos. Outra micobactéria tuberculosa de importância, que não faz parte do MTBC, é o Mycobacterium canettii, oriunda de um ancestral comum ao MTBC e identificada causando TB em humanos no leste africano. Esses são os patógenos de maior relevância para TB humana, sendo a doença zoonótica ou não. Independente do ecotipo bacteriano, a principal característica da patogênese das micobactérias tuberculosas é sua capacidade de sobreviver no interior de macrófagos por meio da manipulação das vias microbicidas. Por consequência, a persistência intracelular dessas bactérias leva a apoptose ou necrose dos macrófagos, contribuindo para controle ou disseminação da infecção. Diversos estudos avaliaram a interação de M.tb com macrófagos e sua persistência intracelular, porém, poucos incluem outros representantes do MTBC. Assim, os objetivos deste estudo foram inicialmente (i) desenvolver uma metodologia de quantificação de bactérias do MTBC (M.tb, M. africanum L5 e L6, M. bovis, M. caprae) e M. canettii por citometria de fluxo, para facilitar o desenvolvimento dos experimentos e, em seguida, (ii) comparar as dinâmicas da infecção das espécies de MTBC e M. canettii em macrófagos THP-1 avaliando a taxa de infecção, índice de fagocitose e morte celular. Primeiramente, verificamos que a quantificação por UFC (unidades formadoras de colônias) de M.tb em meio sólido Middlebrook 7H10 ou 7H9-Ágar suplementados com 10% de OADC (ácido oleico, albumina, dextrose e catalase) e 18 mM de piruvato de sódio é cerca de 10 vezes maior que as outras espécies do MTBC e M. canettii. Para compreender essa discrepância, o citômetro de fluxo LSR Fortessa™ Cell Analyzer (BD Biosciences) foi empregado para quantificar as bactérias cultivadas em meio líquido comparando duas metodologias de fluorescência: marcação com CF-SE (5-(e-6) carboxyfluorescein, succinilmidyl ester) e transformação com plasmídeo pMSP::dsRed2. Enquanto o CF-SE marcou apenas 40 a 80% das bactérias, dsRed2 foi expresso em ˜100% das populações bacterianas. Bactérias-dsRed2 puderam então ser quantificadas com acurácia pela citometria de fluxo após ajustes em threshold de PE (phycoerythrin) e voltagem PMT (tubo fotomultiplicador) de FSC (forward scatter) para a diminuir a oscilação do equipamento e a taxa de aborto de eventos, com baixo false discovery rate (FDR) e coeficientes de variações entre replicatas. Com a nova metodologia, as quantificações por UFC e citometria de fluxo mostraram-se equivalentes para M.tb, mas significativamente diferentes nas outras espécies avaliadas, indicando que o meio sólido não é capaz de suportar o crescimento adequado de espécies não-M.tb. Em seguida, com o novo protocolo de quantificação bacteriana, comparamos as taxas de infecção e os índices de fagocitose em macrófagos THP-1 das bactérias do MTBC e M. canettii utilizando diferentes multiplicidades de infecção (MOIs de 2:1, 5:1, 10:1 e 20:1). Ambos os índices se comportaram de forma dose-dependente para todas as espécies, exceto para M. caprae, que apresentou índices semelhantes em todas as MOIs, em níveis que só foram obtidos em MOIs mais elevadas (10:1 e 20:1) pelas outras espécies do MTBC. Adicionalmente, os índices de M. canettii superaram significativamente os das espécies do MTBC em todas as MOIs. Para explicar este achado, sequenciamos o genoma completo de M. canettii e mostramos que a estirpe testada perdeu uma das cópias do gene pks5 (policetídeo sintase 5) responsável pela síntese de lipooligossacarídeos. A perda espontânea deste gene tem sido associada a uma maior infectividade de M. canettii em macrófagos, explicando os achados. Por fim, os níveis de morte celular avaliados durante 96h indicam que M. bovis e M. caprae induzem níveis maiores de apoptose 24h p.i. em macrófagos THP-1. À medida que a infecção progride, os níveis de necrose aumentam, entretanto M. caprae superou todas as espécies em 72h e 96h de infecção. Em conclusão, esse é um estudo comparativo entre as espécies do MTBC que traz importantes contribuições metodológicas e de entendimento da infecção do macrófago por espécies do MTBC e M. canettii.