Métodos de biologia molecular e esferoplastização aplicados a Rhizobiaceae - Valarini, Maria José (1989)
O presente trabalho objetivou o estudo de alternativas de transferência genética em Rhizobium e Bradyrhizobium. Para tal, células de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli C05 e de Bradyrhizobium spp, isolado natural da leguminosa forrageira tropical Neonotonia wightii, foram ensaiadas para alguns métodos de biologia molecular, incluindo introdução de elemento de inserção genética e utilização de vetor de clonagem, isolamento de mutantes, detecção de plasmídios em gel de agarose, isolamento de DNA total e construção de banco genômico em E. coli e esferoplastização. Mutantes metionina-deficientes induzidos por U.V. e por introdução do transposon Tn5, foram isolados com freqüências de 0,7x.10-3 (0,15%) e 0,6.10-3 (0,18%), respectivamente, e utilizados como marcadores genéticos, em conjugação triparental. Introdução do transposon Tn5, através do vetor suicida pJB4JI portador do fago Um, em R. leguminosarum biovar phaseoli C05 se deu a uma freqüência da ordem de 10-3. O perfil de DNA plasmidial, em gel de agarose, obtido para ambas as espécies mostrou a presença de banda plasmidial para a espécie de Rhizobium mas não para a espécie de Bradyrhizobium, reiterando a dificuldade de detecção deste elemento ou que neste gênero os genes nif e nod não estejam localizados em grandes plasmídios. Através de pré-tratamento com glicina e, em seguida, com lisozima foi possível obtenção de esferoplastos e/ou protoplastos em 90% das células com menos de 6 horas de tratamento. Células de Rhizobium e Bradyrhizobium apresentam resistência à reação de lisozima. Utilizando-se do vetor de inativação insercional pUC 119 foi construído um banco genômico de DNA total da estirpe de Bradyrhizobium spp, e estabelecido, por transformação, em E. coli HB101. O plasmídio híbrido resultante conteve fragmentos de DNA de 10-20 kilobases inseridos no sítio de poliligação da região lac z do pUC 119. Mobilização de plasmídio pSUP 5011::Tn5 mob+ para R. leguminosarum biovar phaseoli C05 foi observada a uma freqüência de 0,4.10-5, através de sistema plasmidial binário, incluindo o vetor de transcomplementação pRK2013 (tra+).