Elucidação dos mecanismos e fatores celulares envolvidos na redistribuição intracelular de SERINC5 promovida por Nef do HIV-1 - Costa, Cristina Santos da (2024)
SERINC5 é um fator de restrição que diminui drasticamente a infecciosidade do HIV-1. Expresso na membrana plasmática, SERINC5 é incorporado nas partículas virais recém-sintetizadas, comprometendo a capacidade desses vírus de infectar uma nova célula-alvo. Em contrapartida, o HIV-1 codifica a proteína multifuncional Nef, capaz de impedir a incorporação de SERINC5 nos vírus ao manipular a maquinaria de tráfego intracelular de proteínas. Especificamente, Nef acelera a endocitose de SERINC5 da membrana plasmática, mediada pelo complexo adaptador de clatrina 2 (AP-2), removendo SERINC5 do sítio de montagem e brotamento do HIV-1. No entanto, os componentes celulares e o mecanismo molecular envolvido não são totalmente compreendidos. O presente estudo teve por objetivo principal elucidar os mecanismos pelos quais Nef do HIV-1 altera o tráfego subcelular de SERINC5. Iniciamos esse estudo identificando o compartimento intracelular para o qual Nef redistribui SERINC5. Através de imunofluorescência e microscopia confocal, observamos que Nef induz um acúmulo de SERINC5 na região perinuclear, colocalizando com um marcador de Golgi em células HeLa. Uma vez que o complexo AP-1 - já bem descrito parceiro de interação de Nef - seleciona e controla o tráfego de proteínas-cargas entre endossomos e o complexo de Golgi, investigamos se AP-1 apresenta um papel neste efeito de Nef. Para isso, células HeLa wildtype (WT) ou AP-1µ1a knockout (KO) foram analisadas por meio de imunofluorescência e microscopia confocal, citometria de fluxo, ultracentrifugação de partículas virais e western blot. As análises dos dados mostraram que, na ausência de AP-1, Nef mantém sua habilidade de remover SERINC da membrana plasmática, provavelmente via AP-2. Porém, ao invés de induzir o acúmulo da proteína no complexo de Golgi, SERINC5 foi observado em um padrão vesicular associado a compartimentos positivos para LAMP-1, um marcador da via endocítica tardia. Um fenótipo similar foi encontrado utilizando o ensaio de uptake de anticorpo, sugerindo que AP-1 desenvolve um papel essencial na aceleração do tráfego retrógrado de SERINC5 promovido por Nef. Este trabalho também mostrou que Nef é capaz de interferir na saída de SERINC5 recém-sintetizado do Golgi, o que pode contribuir para a retenção intracelular de SERINC5 observada. Os resultados preliminares de produção de vírus e visualização por western blot demonstraram que, aparentemente, a ausência de AP-1 não comprometeu a capacidade de Nef de reduzir a incorporação de SERINC5 nas partículas virais. No entanto, a depleção de AP-1 reduziu a produção viral, e resultou também na diminuição da incorporação de SERINC5 no HIV-1 independente de Nef. De fato, as análises seguintes demonstraram que a localização de SERINC5 na membrana plasmática, bem como sua estabilidade, são alterados na ausência de AP-1. Em conjunto, os dados deste trabalho revelou que Nef altera tanto o tráfego retrógrado quanto o anterógrado de SERINC5, induzindo sua acumulação no complexo de Golgi de forma dependente de AP-1. Também foi demonstrado que AP-1 atua no tráfego regular de SERINC5, possivelmente desempenhando um papel relevante para a incorporação dessa proteína nos vírus.