Caracterização funcional de linfócitos T-CAR anti-CD19 polarizados para o fenótipo Th17 através da superexpressão de RORγt - Brand, Heloisa (2022)
A transferência adotiva de linfócitos T modificados para expressar receptores de antígeno quiméricos (CAR) anti-CD19 tem resultado em taxas de remissão completa superiores a 80% em pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células B. Entretanto, a resposta clínica é inferior (~30%) mesmo em outras neoplasias de células B, como a leucemia linfocítica crônica. Em tumores sólidos, o desafio é ainda maior, pois as células T-CAR apresentam-se ineficientes devido à baixa persistência, dificuldade de infiltração e exaustão funcional. Como alternativa para elevar a eficácia das células T-CAR, evidências pré-clínicas indicam que linfócitos polarizados para o fenótipo T helper 17 (Th17) são mais eficientes na erradicação de tumores do que células Th1. A polarização para Th17 in vitro envolve o cultivo das células com coquetel de citocinas e anticorpos neutralizantes, que é um processo dispendioso para a manufatura de células T-CAR. Em resposta às citocinas, o fator de transcrição receptor órfão relacionado ao ácido retinoico gama 2 (RORγt) orquestra a polarização para Th17. Assim, hipotetizamos que a coexpressão do CAR e de RORγt em células T humanas geraria células T-CAR com fenótipo Th17. Para testar nossa hipótese, produzimos vetores lentivirais contendo os genes codificantes do CAR anti-CD19 e/ou RORγt (para produção das rTh17-CAR). Para fins de comparação, também estabelecemos o método de polarização em Th17 por cultivo com citocinas e anticorpos (cTh17). Após a transdução, avaliamos a citotoxicidade das células T-CAR in vitro e in vivo contra células Raji modificadas para expressar luciferase. A citotoxicidade in vitro foi monitorada durante cocultivo com células Raji pela quantificação da bioluminescência e a liberação de IL-17 e IFN-γ foi mensurada por ELISA. Durante o estabelecimento da polarização em Th17 por citocinas, observamos que o uso do agonista de RORγt aumentou em ~45% a transcrição de IL-17A, sem alterar a transcrição de RORC2. Portanto, adicionamos o agonista de RORγt ao protocolo de produção das cTh17. Após transdução para expressar CAR e/ou RORγt, células cTh17-CAR, rTh17-CAR e CD4-CAR misturadas com células CD8-CAR na proporção 1:1 apresentaram citotoxicidade in vitro semelhante contra células de linfoma CD19+. Observamos também que as células CD4-CAR e cTh17-CAR exibem citotoxicidade na ausência de células CD8. Ainda, a coexpressão de CAR e RORγt gerou células T-CAR com perfil Th17, definido pela secreção de IL-17 (~1000 pg/mL/24h). A secreção de IL-17 por células cTh17 foi de ~2000 pg/mL/24h e células não polarizadas apresentaram secreção insignificante. Em um modelo in vivo de linfoma disseminado, as populações rTh17-CAR/CD8-CAR e cTh17-CAR/CD8-CAR apresentaram uma capacidade antitumoral inferior às CD4-CAR/CD8-CAR convencionais, indicando que a atividade superior das Th17 antitumorais pode depender do tipo de neoplasia. Compreender essas particularidades é essencial para aproveitar ao máximo o potencial terapêutico das células Th17. Concluímos que a superexpressão de RORγt gera células com perfil Th17, cuja eficácia tem sido demonstrada em modelos pré-clínicos de neoplasias sólidas. Nossos dados estabelecem uma estratégia simplificada para manufatura de células T-CAR com fenótipo Th17, que pode ser aplicada para avaliação da eficácia terapêutica desta população em outras neoplasias.