Estudo dos genes codificadores de citocinas implicadas na modulação da leishmaniose tegumentar americana e correlação com os achados clínico-laboratoriais da doença - Hippolito, Daise Damaris Carnietto de (2017)
A resposta imune desencadeada em pacientes com leishmaniose tegumentar Americana (LTA) é predominantemente celular. Assim, o estudo dos mecanismos imunológicos responsáveis pela formação, progressão e cura desta infecção é de grande importância, considerando a deformação que ela pode causar em indivíduos infectados. Este estudo investigou a expressão de mRNA de IFN-?, IL-10, IL-27, TNF-?, TGF-? e IL-6 em 40 biopsias de parafina (FFPE) fixadas em formalina de pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial para LTA. Um grupo de 10 biópsias FFPE coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de leishmaniose mucosa (LM) foi utilizado para o controle da evolução da infecção. Inicialmente, foi padronizado a extração de RNA, a síntese de cDNA e a escolha do gene endógeno em 9 biopsias frescas e 8 FFPE. Após essas padronizações, as moléculas de RNA de fragmentos de biopsias parafinadas, foram extraídas com kit específico, tratadas com DNase, quantificadas por fluorimetria e sintetizadas para cDNA. A expressão relativa de cada citocina foi determinada (em duplicata) por PCR em tempo real. As reações foram normalizadas frente ao padrão de expressão do gene endógeno GAPDH, que foi previamente padronizado. O padrão de expressão de cada gene alvo foram determinados segundo a fórmula do \"CT comparativo\" (2-??CT), na qual calcula-se quantas vezes mais ocorre a expressão do gene alvo em relação a indivíduos normais. Também incluído nesse estudo 5 amostras de biopsia de pele de indivíduos normais (grupo IV). Os resultados foram expressos em média de quantificação relativa, a análise estatística foi realizada utilizando foi determinada por Teste t não pareado e teste F para comparação de variâncias, onde três grupos de pacientes foram formados. Grupo I, 35 pacientes com LTA, cuja expressão relativa de IFN-? foi inferior a 100. Grupo II, 5 pacientes com LTA cuja expressão relativa de IFN-? foi superior a 100. Grupo III, 10 pacientes com leishmaniose mucosa. Os níveis de expressão para IFN-? foram 33,34; 214,1 e 129,6 vezes maiores para os Grupos I, II e III, respectivamente do que as amostras do controle normal. Para o TNF-? foram 11,22; 2,37 e 4,59 vezes superiores ao normal nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para IL-10 foram 5,14; 11,54 e 2,51 vezes superiores aos valores normais nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para IL-27 foram 15,81; 85,29 e 17,29 vezes superiores ao normal nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para o TGF-? foram 5,38; 4,33 e 4,72 vezes superiores ao normal nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para a IL-6 foram 5,92; 5,69 e 2,09 vezes superiores aos valores normais nos Grupos I, II e III, respectivamente. Estes resultados foram semelhantes a resultados de estudos que analisam a expressão de citocinas já sintetizadas. No geral, os resultados de expressão gênica das citocinas estudadas sugerem que a exacerbação da resposta imune do perfil Th1 (IFN-?) poderia levar ao surgimento de lesões mais graves nos pacientes dos Grupos II e III. Os níveis elevados de mRNA de IL-10, observado nos pacientes do Grupo II podem promover baixa ativação macrofágica, colaborando com a replicação do parasita e assim culminar com a progressão da doença. A expressão de mRNA de IL-27 não interferiu na expressão de mRNA de IFN-? nas células dos pacientes com leishmaiose tegumentar ou leishmaniose mucocutânea. Em conclusão, estes resultados podem sugerir que os pacientes do Grupo II podem desenvolver formas mais graves de LTA quando comparados aos do Grupo I.