Caracterização funcional e estrutural de uma nova fosfolipase A2 ácida de Bothrops moojeni - Silveira, Lucas Blundi (2012)
As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica.