Avaliação de diferentes protocolos de extração de DNA para detecção de Brucella abortus a partir de diferentes tecidos de vacas infectadas experimentalmente com a cepa 2308

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Ruibal, Maria Del Pilar Vejarano
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: B. abortus; Cows; DNA extraction; Extração de DNA; PCR; Vacas
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-13072009-111831/

Este estudo comparou o desempenho de quatro protocolos de extração de DNA a partir de homogeneizados de diferentes órgãos provenientes de vacas infectadas experimentalmente com a B. abortus 2308. Os protocolos de extração comparados foram o método de GT (lise com isotiocianato de guanidina), Boom (lise com GT e tratamento com suspensão carreadora Diatomaceous earth), PK (lise com proteinase K) e Santos (lise por fervura e congelamento com nitrogênio líquido). Foram constituídos os grupos padrão ouro positivo e negativo baseados na bacteriologia clássica e compostos por: 54 cotilédones (27 pos. e 27 neg.), 39 linfonodos supra mamários (12 pos. e 27 neg.), 44 pré-escapulares (17 pos. e 27 neg.), 33 fígados (6 pos. e 27 neg.), 37 baços (10 pos. e 27 neg.), e 34 úberes (7 pos. e 27 neg.). Todas as amostras foram submetidas aos quatro protocolos de extração e a um mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. Nos resultados consolidados por órgãos, a proporção de positivos no cotilédone foi maior do que a encontrada no linfonodo supramamário (p=0,0001), linfonodo pré-escapular (p<0,0001), fígado (p=0,0006), baço (p<0,0001) ou úbere (p=0,0019). Os resultados acumulados para os métodos de extração mostraram que o protocolo de Santos teve maior sensibilidade relativa do que o método de Boom (p=0,003) e GT (p=0,0506), e foi igual ao PK (p=0,2969). As demais comparações de proporções não resultaram em diferenças estatisticamente significantes. No estudo verificou-se amostas positivas a PCR e negativas ao isolamento e viceversa. Assim, apesar das desvantagens do método bacteriológico clássico, a melhor estratégia para o diagnóstico direto da infecção de vacas por B. abortus em homogeneizado de órgãos é a utilização conjunta do isolamento e da PCR, examinando os cotilédones e utilizando os métodos de extração de DNA Santos ou PK.