Caracterização da atividade transcricional de HPV-6 - Caodaglio, Amanda Schiersner (2020)
As verrugas genitais (VG), a papilomatose respiratória recorrente e alguns raros casos de câncer estão associados à infecção pelo HPV-6. Variantes da sublinhagem B1 de HPV-6 estão associadas a um maior risco de desenvolvimento de VGs em homens em comparação às variantes da sublinhagem B3, o que poderia estar em parte associado à maior atividade transcricional da variante B1 quando comparada à variante B3. A transcrição viral é regulada por proteínas celulares e virais que se ligam à LCR e pouco foi descrito sobre a regulação da transcrição do HPV-6. Portanto, os objetivos deste trabalho foram identificar fatores de transcrição (FTs) que afetam a transcrição do HPV-6; identificar FTs que atuam distintamente na transcrição das variantes B1 e B3; determinar quais FTs se ligam à LCR; e determinar o impacto dos FTs sinergicamente na transcrição do HPV-6. Usando a tecnologia GFC-Transfection Array (Origene), mais de 700 plasmídeos de expressão de FTs foram transformados em bactérias E. coli e o DNA plasmidial isolado por minipreparação. Em seguida, células C33 foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão de FTs e plasmídeos repórteres recombinantes LCR-Luc. Foi observado que 77 FTs ativaram ou reprimiram a LCR de pelo menos uma das variantes testadas. Entre estes, 9 FTs apresentaram potenciais sítios de ligação na LCR de ambas as variantes, baseado em análise in silico, e foram selecionados para ensaios de validação em que células C33 foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter, além de quantidades crescentes dos plasmídeos de expressão de cada FT. Assim, verificou-se que SNAI2 e E2F1 reprimiram significativamente a atividade da LCR da variante B1, enquanto, HOXA13 ativou significativamente apenas a LCR dessa variante. Adicionalmente, ELF5 apresentou efeito transrepressor sobre a LCR de ambas as variantes testadas. Ensaios de co-transfecção de FTs para avaliar o impacto sinergético destes FTs sobre a LCR revelaram que quando HOXA13 é co-expresso com SNAI2 o efeito ativador e repressor destas proteínas, respectivamente, é anulado. Ensaios de imunoprocipitação de cromatina (ChIP) mostraram a ligação in vitro de HOXA13 e SOX7 à LCR de ambas as variantes. Estes resultados indicam um papel de HOXA13 na ativação diferencial da transcrição da variante pertencente a sublinhagem B1, em comparação com a atividade transcricional da variante B3. A identificação de FTs celulares que interagem diferencialmente com a LCR de diferentes variantes do HPV-6 poderia explicar, pelo menos em parte, as diferenças no risco de desenvolver VGs atribuídos a essas variantes e futuramente servir como um potencial alvo terapêutico