Purificação de miosina de cérebro de coelho: estudos de interação com actina de músculo esquelético e de cérebro e comparação estrutural e enzimática com miosina de aorta - Ferro, Jesus Aparecido (1983)
Desenvolveu-se uma metodologia para a purificação de miosina a partir de cérebro de coelho. Este procedimento envolve extração de actomiosina em solução de baixa força iônica e separação da actina e da miosina por cromatografia de filtração em gel, em alta força iônica, na presença de ATP e pirofosfato. A miosina de cérebro, em coluna de Bio-Gel A-15 m (200 - 400 mesh), foi eluída como um único pico de atividade K+ -EDTA ATPásica, com o mesmo volume de eluição da miosina de aorta de coelho. Semelhante ao observado para as miosinas de músculo esquelético e liso e para outras miosinas citoplamáticas, em 0,6 M KCl a miosina de cérebro foi maximamente ativada por EDTA, parcialmente estimulada por Ca2+ e inibida por Mg2+. Em gel de poliacrilamida com SDS, a miosina purificada de cérebro apresentou: a) um componente principal com migração semelhante à das cadeias pesadas das miosinas de músculo esquelético e aorta, as quais apresentam P.M. de 200.000 daltons; b) três polipeptídeos menores, com pesos moleculares aparentes de 20.000, 19.000 e 17.000 daltons. Os polipeptídeos de peso molecular 20.000 e 17.000 daltons apresentaram a mesma mobilidade eletroforética relativa das duas cadeias leves da miosina de aorta (LC20 e LC17). Estes três polipeptídeos possivelmente representam as cadeias leves da miosina de cérebro. A miosina purificada de cérebro, semelhante à miosina de músculo esquelético, foi capaz de interagir fisicamente com as actinas de cérebro e de músculo esquelético resultando em uma inibição de sua atividade K+-EDTA ATPásica por estas duas actinas; entretanto, a quantidade de actina necessária para inibir em 50% a atividade foi sempre menor para a miosina de cérebro. Por outro lado, a atividade Mg2+ -ATPásica da miosina purificada de cérebro não foi estimulada pela actina de cérebro e nem pela actina de músculo esquelético, embora a actina de cérebro fosse capaz de ativar a atividade Mg2+ -ATPásica da miosina de músculo esquelético com a mesma eficiência da actina muscular. Nenhuma diferença foi observada entre as miosinas de cérebro e de aorta na inibição da atividade K+ -EDTA ATPásica. Ainda que as miosinas de cérebro e de aorta não sejam distinguíveis pela interação com actina de músculo esquelético; Km para ATP da atividade K+ -EDTA ATPásica e energia de ativação das atividades Ca2+ e K+ -EDTA ATPásicas, estas duas miosinas podem ser diferenciadas em termos de: a) composição polipeptídica; b) valores de atividade específica; c) efeito da força iônica (KCl) sobre a atividade Ca2+ -ATPásica; d) concentração de Ca2+ requerida para atividade máxima e, e) sensibilidade das atividades Ca2+ - e K+ -EDTA ATPásicas ao reagente p-hidroximercuribenzoato (PHMB). Os resultados apresentados neste trabalho indicam que a miosina purificada de cérebro é própria do tecido nervoso, semelhante, porém, distinta da miosina de vaso. A partir desta caracterização estrutural e enzimática, progressos poderão ser feitos no sentido de esclarecer, em termos moleculares, a participação da actina e da miosina em funções neuronais.