Biologia estrutural de enzimas relacionadas com a formação do grupo (S)-4-amino-2-hidroxibutirato (AHBA) durante a biossíntese de butirosina. - Arenas, Laura Alejandra Rivas (2020)
A butirosina é um aminoglicosídeo produzido por Bacillus circulans que apresenta um grupo (S)-4-amino-2-hidroxibutirato (AHBA) ligado à aglicona 2-deoxiestreptamina (2-DOS). A presença do grupo AHBA é capaz de diminuir a suscetibilidade do antibiótico às enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs) produzidas por bactérias patogênicas. Porém, a biossíntese do grupo AHBA é pouco compreendida. Com a intenção de entender a biossíntese desse grupo, estudamos estruturalmente duas enzimas desta via: a BtrJ que catalisa a ligação de uma molécula de L-glutamato com a holo-BtrI, uma proteína carreadora de peptidil (PCP); e a BtrK que descarboxila o intermediário da reação anterior. As enzimas foram super expressas em células competentes de E. coli e posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. Foram realizados ensaios de cristalização mediante as técnicas de difusão de vapor para as proteínas nativas e em presença do sus cofatores. Obtivemos cristais da BtrK e BtrJ que foram difratados em fonte de luz Síncrotron. Os cristais da BtrK pertencem ao grupo espacial P21212. A estrutura da BtrK foi determinada mediante substituição molecular. Estruturalmente, a BtrK apresenta dois domínios: um barril TIM e um barril &#946 sanduíche que interagem entre si. A dimerização acontece pela interação de domínios entre dois monómeros constituindo dois sítios ativos. Um resíduo de lisina Lys49 conservado forma uma base Schiff com o cofator piridoxal-5-fosfato (PLP). O sítio ativo é altamente conservado quando comparado com enzimas homólogas, sendo principalmente hidrofóbico e com um potencial eletropositivo. De acordo com os ensaios de ancoragem molecular, o L-glutamato, substrato parcial da BtrK, não interage diretamente com o PLP, mas faz ligações com resíduos próximos que podem ajudar na sua estabilização no bolsão catalítico. Não foi possível detectar um sinal anômalo derivado da incorporação de metais pesados para a BtrJ, mas obtivemos cristais promissores com incorporação de selenometionina. Mediante ensaios de DSF, pudemos inferir a necessidade de holo-BtrI para a formação de um complexo estável com a BtrJ.