Estudos da enzima purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma Mansoni - Pereira, Humberto D\'Muniz (1999)
O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento dessas bases. Uma das enzimas participantes dessa via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado. O cDNA para a PNP de S. mansoni possui 1055 pb e codifica uma proteína de 287 aminoácidos, que apresenta 49% de identidade sequencial quando comparada à PNP de eritrócitos humanos. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL, e uma grande quantidade de proteína de fusão foi produzida (30 mg·L-1). A proteína de fusão é composta por uma proteína ligante de maltose (MBP) e a PNP. Após a purificação da proteína de fusão em uma coluna de amilose, foi realizada a clivagem das duas proteínas utilizando o Fator Xa. O produto de clivagem purificado rendeu cerca de 7 mg de PNP pura, a partir de 30 mg de proteína de fusão. O KM da SmPNP para a fosforólise de inosina é 6,96 µM valor 6,4 vezes menor que o da enzima humana (45 µM) e 1,6 vezes menor que o obtido para a bovPNP (11,34 µM) com o mesmo substrato (inosina). Com relação ao kcat, a enzima humana apresenta valor 32 vezes superior ao da SmPNP: 1,78 s-1 para a SmPNP e 57 s-1 para a enzima humana. Cerca de 30 mg de SmPNP purificada foram utilizados em experimentos de cristalização (~700 condições), e duas condições promissoras foram obtidas: uma utilizando PEG 4000 e 0,1 M de acetato de sódio pH 4,6, e outra utilizando sulfato de amônio em pHs de 6 a 8. Utilizando o programa Modeller, foi construído um modelo tridimensional para a SmPNP tendo como molde as coordenadas da PNP de baço bovino. O modelo mostrou-se razoável quando avaliado segundo critérios de empacotamento e estereoquímicos. O modelo revela duas substituições no sítio ativo quando comparado com a PNP humana; essas diferenças poderão ser exploradas no desenho de inibidores específicos.