Danos físicos em membranas por processos de fotossensibilização - Rosa, Raffaela De (2020)
Nesta tese de doutoramento, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-x a baixos ângulos (SAXS) para: (i) caracterizar membranas modelo (vesículas unilamelares grandes, LUVs) compostas por POPC (PC), PC:esfingomielina (PC:SM, razão molar 1:1) e PC:SM:colesterol (PC:SM:CO, 1:1:1), (ii) estudar mudanças estruturais nestas membranas devido à foto- oxidação in situ na presença de quatro fotossensibilizadores (FS): azul de metileno (MB), azures A e B (AA e AB) e tionina (Ti), (iii) avaliar do ponto de vista estrutural a influência dos lipídios oxidados PC-OOH (POPC hidroperoxidado) e 1-palmitoil-2-azelaoil-sn-glicero- 3-fosfatidilcolina (PAzPC) na composição da membrana lipídica e (iv) investigar os mecanismos de interação e agregação da enzima gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) na superfície de membranas oxidadas e contendo domínios lipídicos. A caracterização inicial de membranas modelo mostrou que a composição lipídica influencia nos parâmetros estruturais como espessura de bicamada e perfil de densidade eletrônica. Bicamadas lipídicas compostas apenas por POPC apresentaram espessura de bicamada lipídica igual a 46(2)Å. Em sistemas compostos por PC:SM (1:1) foi evidenciado aumento de 6.6Å na espessura da bicamada. No caso de membranas compostas por PC:SM:CO (1:1:1) a análise das curvas de SAXS indicou uma coexistência de fases liquido desordenado (Ld)-liquido ordenado (Lo), com diferenças na espessura da bicamada de 9.4Å. No estudo de fotossensi- bilização de membranas, foram analisadas curvas de SAXS de LUVs de PC, PC:SM (1:1) e PC:SM:CO (1:1:1) foto-irradiadas por 2h na presença dos FS MB, AA, AB e Ti. Vesículas compostas por PC:SM:CO apresentaram menor alteração estrutural sugerindo que a presença de domínios lipídicos de SM:CO protegem a bicamada lipidica dos efeitos de foto-oxidação. Ressalta-se aqui que CO també é alvo de foto-oxidação. Para os sistemas PC e PC:SM, o FS Tionina promoveu maior foto-dano na membrana resultando em oxidação lipídica de cerca de 31% para membranas de POPC e de 17% para PC:SM. Foi observado efeito de indução à formação de multilamelas para todas as composições lipídicas com FSs mesmo antes da exposição à foto-irradiação, sugerindo que o FS por si só promove formação de multilamelas. De um modo geral, os efeitos de fotossensibilização observados neste estudo não foram significativos no que se refere a danos físicos em membranas em termos de ruptura das mesmas. Em termos do impacto de lipídio oxidado em membranas modelo, foi observado que a adição controlada de POPC-OOH em bicamadas de POPC leva à diminuição da espessura da bicamada de 46.4(6)Å para membranas puras de PC para 37.6(4)Å quando compostas por 100% de PC-OOH. No caso do sistema PC:PAzPC (67:33) foi obtida espussura de bicamada igual a 42.7(9)Å. Para os sistemas ternários PC:PC-OOH:PAzPC (60:25:15) e (47:25:28) foram observadas espessuras equivalentes aos valores obtidos para PC com 33% de lipídio oxidado (PC-OOH ou PAzPC). A análise dos sistemas PC:PC-OOH e PC:PAzPC via modelo de grupos químicos mostrou que o grupo oxidado OOH do PC-OOH se encontra preferencialmente na região polar da membrana, próximo aos grupos carbonila e fosfato. No caso do PAzPC, o grupo COO apresentou uma distribuição bimodal com localização nas regiões hidrofóbica e hidrofílica da membrana. Por fim, o estudo de interação GAPDH/PC:PC-OOH mostrou que a GAPDH sofre agregação ao longo do tempo de observação independente do nível de oxidação da membrana. A quantificação da estrutura oligomérica da enzima mostrou que na presença de membranas contendo PC-OOH a enzima sofre dissociação da forma inicial de tetrâmero para monômeros ou dímeros, não sendo possível a distinção entre os dois. Para medidas realizadas diretamente após a mistura das soluções (t = 0h) foi observada maior dissociação para vesículas com menor grau de oxidação (PC-PC-OOH (67:33)). Em sistemas compostos por PC:SM:CO e PC-OOH:SM:CO a GAPDH manteve a estrutura de tetrâmero mesmo após 2h de interação indicando que a formação de domínios lipídicos inibe a dissociação da enzima em monômeros ou dímeros.