Sequenciamento e análise de fragmentos cloroplastidiais de tomate para construção de vetores de transformação de cloroplastos via recombinação homóloga - Berger, Irving Joseph (2000)
A coordenação de células vegetais requer a participação de três sistemas genéticos distintos, porém interdependentes durante seu desenvolvimento. Além da informação genética alojada no núcleo, células vegetais contém DNA em seus cloroplastos e mitocôndrias, as quais são organelas semi-autônomas possuidoras de sua própria maquinaria necessária à transcrição gênica, síntese proteica e parte da replicação. O estudo de novas alternativas tecnológicas levou ao desenvolvimento da tecnologia de transformação do genoma cloroplastidial (plastoma) de plantas superiores, gerando otimistas expectativas no melhoramento de plantas. Plantas possuindo genoma cloroplastidial transformado (transplastômicas) possuem algumas vantagens quando comparadas aos transformantes nucleares, pois possibilitam transformação dirigida, garantem segurança ambiental na dispersão de genes via pólen, uma vez que a característica de herdabilidade maternal dos cloroplastos ocorre na maioria das espécies ultivadas, e apresentam extraordinários níveis de expressão do gene introduzido. O sistema de transformação de cloroplastos de plantas superiores foi desenvolvido inicialmente em tabaco e mais recentemente em Arabidopsis thaliana e batata (Solanum tuberosum). As semelhanças genéticas entre tabaco e tomate (ambos pertencentes à família Solanaceae) apontam essa importante espécie como forte candidata ao sucesso na expressão de transgenes, disponibilizando ao melhorista de plantas uma ferramenta altamente eficiente e vantajosa. Visando o desenvolvimento da tecnologia de transformação de cloroplastos de tomate (Lycopersicon esculentum L.) fragmentos cloroplastidiais de tomate IAC-Santa Clara foram clonados e analisados para a construção de vetores de transformação via recombinação homóloga. Isolamento e clonagem de fragmentos PstI/SalI de cloroplastos de tomate deram origem aos plasmídios pIJB1 e pIJB2, contendo fragmentos de 8.660 pb e 6.366 pb respectivamente. Seqüenciamento e análise dos fragmentos revelaram que as seqüências são altamente homólogas aos respectivos fragmentos em tabaco, especialmente nas regiões codificadoras, e o mapeamento gênico mostrou que o posicionamento relativo das regiões codificadoras é também conservado entre as duas espécies. Espaços intergênicos mostraram-se menos conservados, sugerindo que divergências evolutivas ocorram principalmente em áreas não diretamente envolvidas na expressão gênica. Uma diferença bastante marcante encontrada está em um fragmento de 437 pb presente em tabaco entre as regiões codificadoras dos genes trnE e trnT e ausente no DNA cloroplastidial de tomate. Análise do padrão de restrição das seqüências cloroplastidiais apontou a seqüência SmaI/XhoI (2404 pb) contendo o sítio único de restrição StuI entre os genes petN e psbM como opção ideal para a construção de vetores de transformação de cloroplastos de tomate. Foi construído um cassete plastídio-específico atpI-aadA-rps14, que confere resistência aos antibióticos espectinomicina e estreptomicina, o qual foi inserido no sítio StuI na seqüência alvo SmaI/XhoI. Assim, permitiu a construção de dois vetores para transformação de cloroplastos de tomate, pIJB18 e pIJB20 disponíveis para a inserção de novos genes de interesse agronômico nesta espécie. Transformação de cloroplastos poderá facilitar o estudo da regulação gênica cloroplastidial e auxiliar o melhoramento genético de espécies cultivadas. O recente sucesso na expressão de toxinas conferindo resistência a insetos, resistência ao herbicida glifosato e especialmente de hormônio do crescimento humano em cloroplastos de tabaco, levam a acreditar que a tecnologia promete revolucionar o conceito e a aplicabilidade das plantas transgênicas no melhoramento genético.