Análise de interatores da proteína Orc1/Cdc6 de Trypanosoma cruzi. - Lima, Loyze Paola Oliveira de (2019)
Aproximadamente dez milhões de pessoas, predominantemente na América Latina, são acometidas pela doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi. Apesar disso, essa enfermidade apresenta investimentos reduzidos em pesquisas e produção de medicamentos. As drogas atualmente disponíveis para tratar essa doença têm efeitos tóxicos e não são eficazes contra todas as fases da doença ou cepas de parasitas, tornando necessário estudos que apresentem alvos terapêuticos específicos. Nesse contexto, nosso laboratório estuda a replicação do DNA em Trypanosoma, uma vez que caracterizar a replicação deste parasita pode servir como uma ferramenta para buscar possíveis alvos terapêuticos. Neste estudo, investigamos o papel da proteína DNA Polimerase theta-domínio helicase (Pol-helicase) na replicação do T. cruzi. A DNA polimerase theta (Pol) de eucariontes recentes é um membro da família de polimerase e exibe um domínio C-terminal da polimerase, um domínio central e um domínio de helicase N-terminal. A proteína Pol desempenha importantes papéis no reparo do DNA através de seu domínio polimerase, regulando a integridade do genoma. Além disso, em mamíferos, a Pol modula o tempo de disparo da origem e o recrutamento da helicase MCM para a cromatina. Em contraste, o genoma de T. cruzi exibe dois ortólogos putativos individuais de Pol em diferentes locos do genoma; um homólogo ao domínio da polimerase do terminal C de Pol e o outro homólogo ao domínio da helicase, denominado Pol-polimerase e Pol-helicase, respectivamente. Neste estudo, um ensaio de pull-down usando o componente T. cruzi do complexo de pré-replicação Orc1/Cdc6 como isca capturou Pol-helicase do extrato nuclear. Orc1/Cdc6 e Pol-helicase interagiram diretamente e a Pol-helicase recombinante apresentou atividade de desenrolamento do DNA e de ATPase. Além disso, uma cepa de T. cruzi superexpressando o domínio Pol-helicase exibiu uma quantidade significativamente menor de MCM7 ligado ao DNA e prejudicou o disparo na origem da replicação. Utilizamos a metodologia de CRISPR-Cas9 para gerar uma linhagem que expressa a Pol-helicase sem o domínio de helicase, observamos que essa linhagem, de fato, apresentou mais MCM no DNA. Em conjunto, esses dados sugerem que a Pol-helicase modula a replicação do DNA interagindo diretamente com Orc1/Cdc6, o que reduz a ligação do MCM7 ao DNA e, assim, prejudica o disparo das origens de replicação.