Caracterização de um receptor de Trypanosoma cruzi identificado por técnica de phage display - Khusal, Ketna Guilhermino (2011)
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo.