Estudos espectroscópicos da hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp) - Barros, Ana Eliza Barbosa (2014)
A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3.600 kDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta proteína apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho, foi realizado o estudo da estabilidade da oxi-HbGp frente aos processos de dissociação oligomérica e desnaturação, utilizando duas classes de desnaturantes, ou seja, o surfactante brometo de dodeciltrimetilamônio (DTAB), e os agentes caotrópicos cloridrato de guanidina (GuHCl) e ureia. Convém mencionar ainda, que este estudo foi desenvolvido através do uso de duas sondas fluorescentes, 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (1,8-ANS) e fluoresceína isotiocianato (FITC), usando as técnicas de absorção óptica, fluorescência estática, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e fluorescência resolvida no tempo. Os resultados de fluorescência estática mostram que o DTAB induz um aumento na intensidade de emissão de fluorescência da sonda ANS, com o deslocamento do máximo de emissão para o azul de 517 para 493 nm. Duas transições são observadas, em 2,5 e 9,5 mmol/L de DTAB, e estão associadas à interação da sonda ANS com agregados pré-micelares e micelas, respectivamente. Na oxi-HbGp, ANS liga a sítios menos expostos ao solvente, quando comparado às micelas de DTAB, caracterizados pela emissão em 467-472 nm. A adição de DTAB ao sistema oxi-HbGp-ANS, no pH 7,0, induz a agregação da proteína, a dissociação oligomérica e desenovelamento da oxi-HbGp. No pH 5,0, a formação de agregados não foi observada. Além disso, o processo de desenovelamento induzido pelo DTAB apresenta duas transições, a primeira em virtude da dissociação oligomérica, e a segunda, provavelmente, devido à desnaturação das subunidades dissociadas. Por outro lado, GuHCl e ureia com concentrações acima de 1,5 e 4,0 mol/L respectivamente, induzem a desnaturação completa da oxi-HbGp, com redução dos grupos hidrofóbicos na superfície da proteína, e o deslocamento do ANS para o meio aquoso, detectado pela redução de intensidade de fluorescência. A técnica de fluorescência resolvida no tempo permitiu avaliar os valores dos tempos de vida para a sonda 1,8-ANS, bem como, para oxi-HbGp. Por último, a oxi-HbGp foi marcada com a sonda covalente fluoresceína isotiocianato (FITC) em dois valores de pH 7,0 e 9,0, e nas proporções sonda:heme de 1:5 e 2:1. A quantidade de FITC efetivamente ligada a oxi-HbGp por heme foi estimada a partir dos dados de absorção óptica. Supondo que o rendimento quântico de FITC no tampão é 100%, os rendimentos quânticos de FITC ligada a oxi-HbGp também foram encontrados. Além disso, estudos preliminares de dissociação e desnaturação da oxi-HbGp marcada com FITC, na presença do surfactante DTAB, foram realizados.