Interação materno-embrionária in vitro mediada por vesiculas extracelulares em bovinos - Silva, Amanda Nespolo (2023)
Em ruminantes, o reconhecimento materno da prenhez (MRP) envolve a produção de interferon tau (IFNT) pelas células do trofectoderma (TE) do embrião para prevenir a luteólise. Apesar da sinalização IFNT ser caracterizada, a produção e liberação de vesículas extracelulares (VEs) surgiu como um potencial mecanismo de comunicação celular entre a mãe e o embrião durante a MRP. A hipótese deste projeto é que as células do endométrio e do TE cultivadas in vitro podem produzir e liberar VEs, que podem ser internalizadas e modulam o transcriptoma nas células-alvo. Para testar essa hipótese, geramos culturas de células endometriais (origem epitelial e estromal) e de células do TE de blastocistos FIV e isolamos as VEs dos meios de cultura. As linhagens de células epiteliais e estromais (n = 5) foram isoladas, mantidas até a 4ª passagem e, posteriormente, caracterizadas por imunofluorescência (anti-citoqueratina, células epiteliais e anti-vimentina, células estromais). As células do TE dos embriões FIV foram cultivadas até a 2ª passagem e caracterizada por imunofluorescência (anti-CDX2). As VEs isolados foram avaliadas quanto ao tamanho e a concentração de partículas usando Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Em relação a caracterização das células endometriais observamos que apenas células epiteliais foram positivas para citoqueratina e as células estromais foram positivas para vimentina, como esperado. As células do TE foram positivas para CDX2. As VEs mostraram um tamanho médio de 131,92 ± 5,52, 153,46 ± 7 e 143,66 ± 4,60 e concentração 6,54E+08 ± 4,57E+07, 8,15E+08 ± 4,59E+07 e 2,56E+11 ± 1,61E+10 partículas/mL, para células epiteliais, estromais e do TE, respectivamente. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre os grupos estudados. A caracterização das VEs por Western blotting confirmou a presença de ALIX e a ausência da proteína GRP78 nas VEs. Além disso, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostrou que as VEs possuem morfologia e tamanho esperado (<150nm). Para simular o “crosstalk” materno-embrionário in vitro e investigar como as VEs modulam os transcritos nas células alvo, realizamos o tratamento das células endometriais com VEs do TE e vice e versa, o tratamento das células da TE com VEs das células endometriais. Após 6 horas de tratamento, o RNAseq revelou que as VEs da linhagem do TE dos embriões alteraram de maneira mais ampla o perfil transcricional das células estromais em comparação com as células epiteliais. Alguns dos genes significativamente alterados (P<0,05) fazem parte de vias de sinalização importantes como a da via PI3K/Akt, que é fundamental durante o período do desenvolvimento pré-implantação, a via ECM-receptor interaction, que está diretamente relacionada com processos do contato inicial do embrião com o endométrio materno, a via de sinalização Cytokine-cytokine, que é crucial durante as respostas imunológicas e inflamatórias, dentre outras. Com os resultados gerados neste estudo, foi possível gerar pela primeira vez o modelo in vitro que mimetiza o microambiente de comunicação materno embrionária inicial com a troca de VEs entre células endometriais e embrionárias. Esperamos utilizar o conhecimento aqui gerado, para esclarecer os efeitos específicos das VEs, tornando o ambiente da fertilização in vitro mais próximo ambiente in vivo. Materno-embrionária, Vesículas extracelulares, Epitelial, Estromal, Trofectoderma