Construção de vírus Rocio recombinante para expressão de genes repórter - Melo, Danilo Machado de (2023)
O vírus Rocio, um Flavivirus brasileiro, produz epidemias com casos de infecção do sistema nervoso central humano que são muito graves, como foi evidenciado no Vale do Ribeira, SP, na década de 1970. Entretanto, achados soroepidemiológicos e encontros eventuais de indivíduos infectados com ROCV tem sido relatados, o que indica a circulação atual do vírus Rocio no Brasil, embora quase silenciosa. Há risco de re-emergência do vírus Rocio causando epidemias no Brasil. Esta Tese mostra como construímos um vírus Rocio repórter, com substância marcadora luminescente facilmente detectável. A construção dos vírus Rocio repórter foi feita expressando mCherry, mNeonGreen e HiBiT-tag. As construções foram feitas por Circular Polymerase Extension Reaction (CPER) onde fragmentos de DNA que perfazem todo o genoma viral foram submetidos a reação de circularização com fragmento Linker. Os genomas virais circularizados foram transfectados em cultura de células HEK 293T seguindo-se por infecção de células C6/36, que produziu sobrenadantes contendo vírus os quais foram coletados e armazenados. A expressão dos genes repórter para mCherry e mNeonGreen foram avaliadas por imunofluorescência, comprovando o resgate de vírus que expressaram estes genes repórter. Em suma, construímos com êxito vírus Rocio repórter contendo marcadores luminescentes e que deverão ter grande utilidade como marcadores da presença viral em muitos estudos futuros.