Análise de genes da família MtN3/saliva expressos no pistilo de Nicotiana tabacum L - Amorim, Marcella de Francisco (2011)
O pistilo é um órgão de importância central na reprodução de plantas, sendo responsável pela recepção, reconhecimento, seleção e aceitação de grãos de pólen. Muitos genes preferencialmente ou especificamente expressos no pistilo podem estar relacionados à reprodução. TOBC023B06, um clone identificado na biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum (TOBEST), foi previamente descrito com uma expressão específica no estigma/estilete. Análises in si/ico indicaram que este pertence à família MtN3/saliva de proteínas de transmembrana. Em plantas, algumas proteínas MtN3/saliva foram descritas (RPGl, Os8N3, NECI e SAG29) e todas estão de alguma forma associadas à reprodução. Apesar desses estudos, pouco se conhecia sobre a função dessas proteínas até recentemente e, assim, o objetivo deste trabalho foi estudar TOBC023B06 e outras proteínas MtN3/saliva expressas no pistilo de N. tabacum. Para entender a função de 23B06, plantas transgênicas de N . tabacum (super-expressando e silenciando 23B06) foram obtidas via Agrobacterium. Plantas de super-expressão apresentaram um estilete alongado (TO) e análises da segunda geração (TI) revelaram plântulas com retardo no crescimento em condições normais e hipersensibilidade à alta salinidade. Plantas silenciadas não apresentaram nenhum fenótipo visível (TO), entretanto sementes da planta com o menor nível de expressão de 23B06 apresentou dificuldades na germinação. Experimentos de expressão transiente (35S::TOBC023B06-eGFP) em folhas e protoplastos indicaram uma localização em membrana plasmática para a proteína 23B06. Análises in silico da proteína 23B06 revelaram a presença de 7 regiões de domínios transmembrânicos e uma porção C-terminal longa e localizada dentro da célula. Além disso, uma sequência genômica parcial correspondendo ao 23B06 foi obtida no Sol Genomics Network (Blastn), revelando 6 éxons e uma região promotora com elementos cis-regulatórios envolvidos com a resposta ao ABA e também alguns elementos necessários para expressão em endosperma. Esses elementos também foram encontrados no promotor do seu ortólogo em Arabidopsis (SAG29), o qual possui elevada expressão durante o desenvolvimento da semente e responde a tratamentos com ABA. Além de TOBC023B06, seis contigs/genes codificando proteínas MtN3/saliva foram encontrados no TOBEST e uma busca por sequências homólogas foram feitas nos genomas de Arabidopsis thaliana e Populus trichocarpa. Sequências de aminoácidos dessas proteínas MtN3/saliva foram alinhadas pelo programa MAFFT e uma árvore filogenética foi construída pelo PhyML3(aLTR). Cinco grupos de possíveis ortólogos entre essas três espécies foram definidos e genes homeólogos (TOBC023B06 e TOBC047C06; TOBC48E05 e TOBC17D07) f oram encontrados em N. tabacum. Cinco genes de Arabidopsis, identificados como ortólogos de proteínas MtN3/saliva de N. tabacum, possuem alta expressão em estruturas reprodutivas: estames, pólen, pistilo e sementes/embrião. Em Populus, dados de expressão para alguns genes foram também encontrados e revelaram altas expressões em inflorescências. Com relação às sequências de N. tabacum, análises de RT-qPCR demonstraram que TOBC017D07/TOBC048E05 é preferencialmente expresso em ovários e TOBC052Fl2 é expresso amplamente em todos os órgãos analisados. Além disso, realizamos novamente a análise de TOBC023B06, visando detectar a expressão desse gene separada do seu homeólogo. Os dados obtidos revelaram que, na verdade, TOBC023B06 possui elevadas expressões não apenas em estigma/estilete, mas também em pétalas e estames. Por outro lado, o seu homeólogo (TOBC047C06) possui expressão específica no estigma/estilete. Apesar dessas diferenças nos padrões de expressão dos homeólogos, ambos os genes são regulados durante o desenvolvimento do estigma/estilete, sendo mais expressos nos últimos estádios em direção a antese. Considerando a função de transportadores de açúcares estabelecida recentemente para proteínas da família MtN3/saliva, e a expressão destes genes em estigma/estilete, que coincide com a produção do exudato rico em açúcares, é possível propor que proteínas MtN3/saliva do pistilo estão envolvidas com o transporte de açúcares para o exudato.