Desenvolvimento de estratégia de genotipagem para discriminação de alelos antitéticos do sistema de grupo sanguíneo Diego utilizando pool de DNA - Carvalho, Thiago Vianna de (2018)
Nesta dissertação, foi proposto o desenvolvimento de uma metodologia molecular por PCR em tempo real (qPCR) utilizando pool de DNA para a detecção de alelos que codificam antígenos importantes do sistema de grupo sanguíneo Diego. Esta ferramenta molecular será útil uma vez que são escassos os reagentes sorológicos para detecção desses antígenos e, quando existem, não permitem uma investigação em larga escala devido à pouca confiabilidade e alto custo. O sistema Diego (DI) possui 22 antígenos, sendo o antígeno Diª mais importante na prática transfusional. Eles são carreados pela proteína da Banda 3 que é proteína mais abundante na s hemácias, com 106 cópias. O antígeno possui uma maior prevalência, em indígenas americanos e asiáticos (6%-52%), já que é considerado um marcador antropológico de ancestrais mongóis; no entanto, a incidência desse antígeno tem aumentado dentre outras populações, como em caucasianos e afrodescendentes, e detectado em doadores de sangue, o que pode resultar em aloimunização de pacientes e dificultando o seu manejo terapêutico. Em contrapartida, a frequência do antígeno Dib em todas as populações é extremamente alta (>99,99%) e encontrar o raro fenótipo Di (a+b-) é ainda mais laborioso do que a busca pelo antígeno Diª. Sabe-se ainda muito pouco sobre a frequência dos antígenos Wrª e Wrb nas diferentes populações, mas estimase que a prevalência seja de 0,01% e >99,99% respectivamente. Foram utilizadas 410 amostras de doadores de sangue e 230 amostras de pacientes para genotipagem em qPCR utilizando pool de DNA para detecção dos alelos DI*01, DI*02, DI*02.03 e DI*02.04. A amplificação individualizada foi realizada quando a reação com pool demonstrou a amplificação de um dos alelos de interesse, DI*01 ou DI*02.03. Procedeu-se também com a clonagem dos alelos após à amplificação com as amostras controle, porém, ocorreu somente a clonagem dos alelos DI*02 e DI*02.03. Os fragmentos clonados apresentaram amplificação excelente e serão utilizados como controle positivo em testes moleculares futuros. Não foi possível a clonagem do DI*01 pelo problema da zigozidade da amostra controle. Houve 100% de concordância entre o resultado da genotipagem e as informações de fenotipagem das amostras controle. O alelo DI*01 ocorreu em 0,6% dos doadores de sangue e 1,7% em afrodescendentes, que corresponde a uma frequência genotípica DI*01/DI*02 de 1,2% e 1,3% respectivamente. Procedeu-se com as análises estatísticas comparativas entre o resultado desta pesquisa e de outras na população brasileira sobre os diferentes genótipos para entender se havia uma diferença estatística considerável. Ainda que a frequência para o genótipo DI*01/DI*02 seja mais baixa em doadores e mais alta em afrodescendentes do que o publicado em outros trabalhos brasileiros, a análise dos dados demonstrou que não havia diferença estatística com a maioria deles. A incidência aumentada do alelo DI*01 na população afrodescendente demonstra o aspecto da miscigenação. Conclui-se que a metodologia proposta funciona e tem aplicabilidade imediata em doadores de sangue e na busca de fenótipos raros. A incidência do alelo para Diª em doadores de sangue está abaixo do que um estudo anterior detectou em Ribeirão Preto (COZAC, 2004), que pode ser explicado pelas diferenças no censo populacional entre os estudos e pela coleta de amostra de universitários (62%). Não foram encontrados os genótipos DI*01/DI*01, DI*02.03/DI*02.03 e DI*02.03/DI*02.04 nas populações estudadas.