Clonagem e caracterização do gene de resistência a nistatina em Saccharomyces cerevisiae - Longo, Adriana Cristina (1991)
O presente trabalho descreve a clonagem do gene de resistência a nistatina, num plasmídio replicativo bifuncional (YRp7) e sua utilização como marcador seletivo dominante na transformação de Saccharomyces cerevisiae. Vinte e um transformantes foram selecionados diretamente em meio de YEPD acrescido de 60 ug/ml de nistatina, após 3 dias de incubação a 30°C. O DNA gnômico dos clones foi extraído e utilizado para transformar E. Coli a fim de recuperar e amplificar os plasmídios recombinantes. Quatro diferentes plasmídios foram isolados e seus pesos moleculares estimados. Verificou-se que três deles não apresentavam os padrões eletroforéticos esperados. Provavelmente, por alterações estruturais ocorridas durante o processo de transformação. Uma nova transformação, com DNA purificado dos quatro plasmídios, foi realizada a fim de confirmar a clonagem. A retransformação em E. coli com DNA total recuperou os mesmos plasmídios. Outras linhagens de S. cerevisiae foram transformadas e foi possível observar que mesmo entre linhagens há uma considerável diferença quanto as suas capacidades de receber, manter e expressar DNA exógeno, pois foi grande a variação nas suas eficiências de transformação. A instabilidade mitótica dos clones quando crescidos em meio não seletivo mostrou que os plasmídios se replicam autonomamente nas células, e que ha uma variação nos seus números de cópias, pois ao testar o nível de resistência dos clones à nistatina, evidenciou-se que eles variam desde 60 ug/ml, para os plasmídios pNYS1 e pNYS3, ate 210 ug/ml para pNYS2 e pNYS4. Os resultados obtidos sugerem que os genes de resistência à nistatina constitui-se num marcador seletivo em potencial para a construção de vetores plasmidiais. Estudos futuros visarão a caracterização, localização e subclonagem, além dos efeitos da resistência à nistatina nas células.