Função e biogênese de vesículas de membrana externa do patógeno oportunista Chromobacterium violaceum - Batista, Juliana Helena (2021)
Vesículas de membrana externa (OMVs) sao nanopartículas esféricas (20-300 nm) liberadas naturalmente para o meio extracelular a partir da membrana externa de bactérias Gram-negativas. Estudos recentes indicam que as OMVs sao importantes tanto na fisiologia quanto nas interacoes bactéria-bactéria e bactéria-hospedeiro, atuando em patogênese, reposta bacteriana a diversos estresses e homeostase da microbiota humana. Neste trabalho, estudamos as vias de biogênese, a composição proteica, a seleção de carga e o papel in vivo das OMVs de Chromobacterium violaceum, um bacilo Gram-negativo ubíquo de vida-livre, que também é capaz de invadir e replicar-se em células eucarióticas. Quanto à biogênese de OMVs em C. violaceum, identificamos três mecanismos distintos, sendo estes mediados pelo sistema de transporte de fosfolipídios VacJ/YrbBCDEF, pela proteína periplasmática DsbA que auxilia no dobramento e estabilidade de proteínas secretadas e pela molécula hidrofóbica antimicrobiana violaceína. Demonstramos que a violaceína controla a vesiculação de C. violaceum ao induzir a sua própria secreção via OMVs, dessa forma promovendo a adaptação de C. violaceum frente à competição contra bactérias Gram-positivas. A taxa de vesiculação de C. violaceum foi controlada por quorum sensing via regulação da síntese de violaceína e do sistema VacJ/Yrb. O sistema VacJ/Yrb apresentou papel fundamental na homeostase da vesiculação e na manutenção da virulência de C. violaceum. Mutantes nulos sem os genes vacJ ou yrbE foram incapazes de invadir células epiteliais e foram completamente atenuados quanto à virulência em modelo murino, apesar de não apresentarem problemas fisiológicos e morfológicos, como demonstramos em ensaios fenotípicos e de microscopia eletrônica. Dessa maneira, estes dados favorecem um modelo no qual o aumento descontrolado da vesiculação é prejudicial para a manutenção de mecanismos de virulência que C. violaceum utiliza durante a invasão de células eucarióticas para o estabelecimento de seu nicho intracelular. Por fim, descobrimos neste trabalho que a proteína DsbA é muito importante para o endereçamento e qualidade de proteínas em OMVs. Nossos dados de proteômica comparativa entre a linhagem selvagem e mutante dsbA revelaram que importantes fatores de virulência que bactérias geralmente utilizam durante a patogênese, como hemolisinas, proteases e lipases, são secretados via OMVs e estão diferencialmente encontrados nas OMVs da linhagem mutante em relação à selvagem. Além disso, a deleção de dsbA impediu que C. violaceum estabeleça a infecção em camundongos, indicando o importante papel de OMVs durante a patogênese in vivo. Portanto, neste trabalho descrevemos mecanismos de vesiculação tanto espécie-específicos, como o mediado pela violaceína, quanto mecanismos mais gerais controlados por genes altamente conservados que potencialmente são empregados por outras bactérias Gram-negativas de relevância clínica. Sendo assim, nosso estudo fortalece a ideia de utilizar sistemas que controlam a biogênese de OMVs, como VacJ/YrbBCDEF e DsbA como importantes alvos antimicrobianos.