Influência da via de sinalização HIPPO na segregação entre a massa interna celular e o trofectoderma em embriões bovinos - Costa, Caroline Pereira da (2020)
O primeiro evento de diferenciação celular em mamíferos consiste na separação entre a massa celular interna (MCI) e o trofectoderma (TE). Em camundongos, a via de sinalização HIPPO atua no controle da expressão de genes que definem essa diferenciação. Em bovinos, há indícios que os mesmos genes não participam da mesma maneira, porém a via HIPPO pode estar implicada nesse evento biológico. No presente estudo buscou-se testar a hipótese de que a atividade da proteína quinase LATS2 é necessária para a diferenciação da MCI em embriões bovinos. Para isso, realizou-se edição gênica via sistema CRISPR/Cas9 com intuito de inibir a função quinase de LATS2. Zigotos bovinos produzidos in vitro foram microinjetados com RNAs guia para o gene LATS2 acrescidos da enzima de restrição Cas9. Os zigotos foram separados em 3 grupos experimentais, sendo: grupo controle (não microinjetado), grupo Cas9 (microinjetado apenas com a proteína Cas9) e grupo gRNA (microinjetado com dois RNAs guias para o gene LATS2 e proteína Cas9). Os embriões foram cultivados para avaliação da taxa de formação de blastocistos, distribuição celular e fixados em paraformol 3,8% para posterior realização da imunofluorescência para YAP, seguido de avaliação de genótipo. Os resultados obtidos sugeriram que a clivagem não foi afetada no grupo editado, sendo as taxas 58%, 36% e 50% para grupo controle, Cas9 e gRNA respectivamente; porém, as taxas de formação de blastocisto sugeriram uma interferência direta no grupo editado, sendo 30%, 10% e 6% respectivamente, para os grupos controle, Cas9 e gRNA. Observou-se no âmbito morfológico que os embriões do grupo gRNA aparentavam estruturas assemelhadas a mórulas, sugestivo de morte embrionária ou bloqueio da diferenciação nessa fase do desenvolvimento. Houve redução numérica no número de células nas estruturas do grupo gRNA. As imagens obtidas via microscopia confocal, após a realização de imunofluorescência para YAP, demonstram a marcação de células do TE nos embriões microinjetados apenas com Cas9 e controle, porém, essa marcação não ocorreu nas no grupo gRNA em embriões que não formaram blastocele. Após a extração individual de DNA dos embriões testados na imunofluorescência, a PCR da região alvo de LATS2 resultou em uma banda de 478pb, além da banda original de 650pb, em uma amostra do grupo gRNA. Após sequenciamento dos produtos de PCR pelo método Sanger, constatou-se a alteração genética oriunda da deleção de trecho do gene LATS2 em 2 embriões, demonstrando o sucesso da edição gênica e corroborando com os demais achados. Isso sugere que a via HIPPO possui papel significativo na diferenciação de MCI e TE em embriões bovinos e de que o gene LATS2 está ligado à formação de blastocistos na espécie bovina.