Efeito do NFAT (factor nuclear de células T ativadas) sobre o controle da expressão de WNK4 (with no lysine kinase 4) em células de néfron distal. - Agostinho, Michelle Sousa (2018)
Este trabalho objetivou avaliar como a expressão de WNK4 (With No Lysine Kinase 4) é modulada por NFAT através da modulação por AngII (Angiotensina II) e Ciclosporina A (CsA). WNK4 é uma cinase que tem papel fundamental na regulação do transporte iônico ao longo do néfron distal, pois fosforila outras cinases (SPAK Proline Alanine-Rich Kinase e OSR1 Oxidative Stress Responsive 1) que fosforilam, e assim ativam, o co-transportador sódio-cloreto sensível aos tiazídicos (NCC), o que acarreta no aumento da reabsorção de sódio, cloreto e água, transporte esse sabidamente regulado pelo hormônio Angiotensina II. O estudo genético que revelou que mutações no gene de WNK geravam um quadro de hipertensão, hipercalemia e hipercalcemia, denominado de pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHAII) ou Sídrome de Gordon, foi crucial para a descoberta da importância das WNKs. Este quadro é revertido quando se utiliza diuréticos tiazídicos, mostrando a relação com o NCC. Interessantemente, um quadro similar ocorre quando pacientes transplantados recebem tratamento com CsA. Estudos comprovam que AngII interfere agudamente no conteúdo da proteína de WNK4, por ativação da PKC e fosforilação da Kelchl3 (Kelh-like 3), culminando com inibição do complexo Ubiquitina-Ligase-E3, importante no processo de degradação da WNK4. Ainda não se sabe qual o papel do NFAT sobre a regulação de WNK4 e como AngII e CsA modulação a transcrição gênica de WNK4. Através dos métodos de westernblotting verificamos que CsA aumenta o conteúdo de WNK4. Por RT-PCR observamos também que AngII e CsA são capazes de aumentar significativamente o mRNA-WNK4 após 24h de incubação. Por ensaio da atividade da luciferase utilizando um vetor que apresenta o gene da luciferase sob o controle de promotor contendo elementos para ligação com NFAT, observamos que AngII parece aumentar atividade de NFAT. Observamos que CsA inibe significativamente a atividade da calcineurina através de ensaio enzimático e AngII não teve efeito significativo. Além disso, amplificamos o promotor do gene de WNK4 por PCR do DNA genômico e seguimos com a clonagem deste fragmento no vetor pGL4.10 (que apresenta o gene de luciferase como gene repórter). Neste constructo, vimos que tanto AngII como CsA são capazes de estimular o promotor do gene de WNK4. Após mutações pontuais para elementos NFAT no promotor de WNK4, observamos que o NFAT pode se ligar em diferentes elementos e essa diversidade gera efeitos estimulatórios e inibitórios na síntese proteica de WNK4, pois os elementos apresentam comportamentos diferentes na regulação da transcrição do gene repórter regulado pelo promotor do gene de WNK4. Assim, concluímos que AngII é capaz de estimular a síntese proteica de WNK4 por via dependente de NFAT.