Estudo do perfil proteico e epigenético do núcleo espermático bovino com influência na produção in vitro de embriões

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Castro, Letícia Signori de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Epigenetic; Epigenética; Espermatozoide; Fertilidade; Fertility; Proteome; Proteômica; Spermatozoa
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-02072019-122723/

A produção in vitro de embriões (PIVE) vem se destacado como biotecnologia reprodutiva nos rebanhos bovinos, porém ainda com algumas limitações. A diferença de fertilidade entre touros é uma delas e dentre os atributos espermáticos que podem impactar na PIVE, pouco se sabe sobre a composição do núcleo espermático. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo principal identificar quais aspectos nucleares do espermatozoide caracterizam a diferença nos índices de PIVE. Para tanto, o estudo foi dividido em 3 experimentos nos quais foi utilizado o banco de dados da empresa In Vitro Brasil para seleção de touros de alta (AF) e baixa (BF) taxa de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivados; n=5 touros/grupo). No primeiro experimento, foi realizado a avaliação da cromatina para susceptibilidade ao desafio ácido (SCSA modificado), deficiência de protaminação (CMA3) e fragmentação do DNA (COMETA). Apenas a deficiência de protaminação apresentou diferença entre os grupos, entretanto a porcentagem de células positivas para o CMA3 foi baixa, não sendo possível atribuir a esta alteração as diferenças de fertilidade encontradas. No segundo experimento, foi realizada a avaliação de proteômica do núcleo espermático destes touros. Para tanto, as amostras foram incubadas com detergente CTAB para remoção de parte da membrana e cauda, extração das proteínas, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massas. A quantificação das proteínas foi avaliada pelo índice iBAQ obtido após a identificação dos peptídeos e a média deste índice comparado entre os grupos para identificação das proteínas diferencialmente expressas. Foram identificadas 196 proteínas, 21 diferencialmente expressas, sendo 17 hiperexpressas no grupo AF e 4 hiperexpressas no grupo BF. Dentre elas, proteínas relacionadas ao processo de espermatogênese, fecundação e motilidade. No terceiro experimento, com objetivo de identificar as marcações epigenéticas relacionadas com a diferença de fertilidade in vitro, foi realizado a avaliação das estruturas de nucleossomos utilizando a enzima MNase para posteriormente utilização na técnica de imunoprecipitação das marcações de histona. Entretanto, não foi identificado a presença de nucleossomos no DNA espermático bovino, inviabilizando análises posteriores. Sendo assim, a avalição da metilação de DNA foi escolhida como marcação epigenética para ser estudada. Neste caso, foi utilizada a técnica de RRBS (reduced representation of bisulfite sequencing) para identificar as citosinas diferencialmente metiladas (CDM) entre os grupos AF e BF. Foram identificadas 440 CDM, sendo 327 hipometiladas e 113 hipermetiladas no grupo AF. Além disto, 184 genes contendo estas CDM foram identificados, entretanto nenhum processo biológico foi enriquecido por estes genes. Foi possível concluir com este trabalho que a fertilidade in vitro pode ser considerada de caráter multifatorial, sendo que alterações pequenas de integridade de cromatina não afetam diretamente, já proteínas relacionadas a espermatogênese, motilidade e fecundação podem ter relação com o fenótipo fertilidade estudado. Dentre as marcações epigenética estudadas, as estruturas de nucleossomo pareceram estar ausentes no espermatozoide bovino, e a metilação de DNA não apresenta impacto significativo no perfil de fertilidade.