Serina proteinases digestivas de insetos-modelo - Tamaki, Fabio Kendi (2011)
Tripsinas e quimotripsinas, enzimas pertencentes à classe das serina proteinases, são as principais enzimas proteolíticas digestivas presentes no intestino médio de insetos de diversas ordens. Entretanto, enzimas de diferentes insetos possuem propriedades cinéticas distintas, sendo os motivos dessas diferenças especulados. Precipitações por sulfato de amônio das tripsinas de Tenebrio molitor, Diatraea saccharalis e Spodoptera frugiperda mostram que insetos Lepidópteros possuem serina proteinases mais hidrofóbicas, que foi confirmado através de cromatografias de interação hidrofóbica e da análise de acesso do solvente às superfícies protéicas em modelagens tridimensionais de seqüências. Tal fato está relacionado à formação de oligômeros e resistência a defesas de plantas. Inativações por TPCK mostram que quimotripsinas digestivas de S. frugiperda, inseto polífago, reagem duas ordens de grandeza mais lentamente e possui um deslocamento do pH ótimo de modificação em mais de uma unidade quando comparada com dos outros dois organismos, fato relacionado à resistência a cetonas presentes em diversas plantas. A tripsina digestiva de Periplaneta americana foi purificada e microsseqüenciada, resultando na seqüência VSPAFSYGTG e associada a um alérgeno (denominado PaTry), expresso nos cecos e na região anterior do ventrículo. O anticorpo anti-tripsina de M. domestica reconheceu apenas uma banda no intestino de P. americana e foi utilizado para imunocitolocalizar tripsinas nos tecidos epiteliais, demonstrando que esta é secretada por exocitose nos cecos e na região anterior do ventrículo, como esperado. Por último, a atividade majoritária de quimotripsina se localiza surpreendentemente na região posterior do ventrículo de M. domestica. Apesar disso, apenas 28% dessa atividade é perdida através das fezes, pois 31% da atividade enzimática se encontra firmemente aderida à membrana, e 41% na fração celular solúvel (associada ao glicocálice), sendo a atividade solúvel luminal correspondente a apenas 12%, indicando a existência de pelo menos duas espécies moleculares distintas, uma solúvel e uma aderida à membrana, comprovado inativações térmicas das duas atividades (solúvel e aderida à membrana) na presença e na ausência de Triton X-100, sendo que a atividade aderida à membrana apresentou uma maior meia vida com uma cinética de primeira ordem nos dois casos. Ensaio em gel demonstrou que o homogeneizado possui apenas uma banda de atividade quimotríptica de 30 kDa. A atividade solúvel majoritária foi purificada até a homogeneidade, apresentando uma banda de 30 kDa em SDS-PAGE, pH ótimo de 7,4 e é 90% inativada por TPCK 0,1 mM em pH 8,5 em 15 min. Ela prefere substratos contendo Phe em P1, apesar clivar substratos contendo Tyr e Leu. Uma seqüência contígua similar a quimotripsina foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de M. domestica, formada por 71 ESTs (de 826 seqüências obtidas ao acaso), indicando que esta deve corresponder à atividade majoritária. Essa seqüência, denominada MdChy1, prediz uma proteína madura de 28.639,2 Da e foi clonada e expressa de maneira recombinante em E. coli BL21 (DE-3) Star, sendo utilizada para produção de anticorpos policlonais em coelhos, que reconheceram uma banda de 30 kDa no ventrículo anterior e posterior, mas não no médio. Esses anticorpos foram utilizados para imunomarcações e reconheceram proteínas no lúmem, nas microvilosidades e em pequenas vesículas do epitélio, demonstrando que a quimotripsina é secretada ao lúmem por exocitose e indicando que o MdChy1 corresponde à atividade majoritária de quimotripsina. Análises de expressão em M. domestica indicam a existência de dois conjuntos de serina proteinases digestivas, um expresso na região anterior e um segundo na região posterior do ventrículo. O MdChy1 é expresso na região posterior, local em que se encontra a atividade majoritária de quimotripsina. Uma reconstrução filogenética dos genes similares a quimotripsinas de Drosophila melanogaster e de M. domestica demonstram que a MdChy1 se agrupa com genes expressos no intestino médio, portanto, com função digestiva.