Otimização do cultivo in vitro visando a transformação genética das cultivares brasileiras de alho (Allium sativum L.) - Scotton, Danielle Camargo (2007)
O melhoramento do alho (Allium sativum L.) está limitado à seleção clonal de genótipos mutantes, uma vez que a quase totalidade do germoplasma da espécie é sexualmente estéril, não florescendo nas condições padrões de cultivo. A esterilidade do alho tem implicações não somente no melhoramento da espécie, mas também influi diretamente nos custos de produção. A necessidade de propagação vegetativa utilizando-se bulbilhos (\"dentes\") como material propagativo facilita a transmissão de doenças por vírus e pragas. A manipulação genética do alho com genes associados ao florescimento via Agrobacterium tumefaciens poderia permitir o desenvolvimento de um sistema mais eficaz para propagação da cultura e habilitar novas combinações genéticas. Portanto, o objetivo desse trabalho foi estabelecer protocolos de regeneração para cultivares comerciais brasileiras de alho, bem como de transformação genética mediada por A. tumefaciens de calos oriundos de segmentos radiculares. Foram utilizadas oito cultivares de alho, divididas em três grupos: semi-nobres de ciclo médio (\'Amarante-Embrapa\'; \'Roxinho 5063\'; \'IAC 75 - Gigante de Curitibanos\'; \'IAC 63 - Mexicano Br\'; e \'Lavínia 1632\'); comum, de ciclo médio (\'Cateto Roxo\') e de ciclo precoce (\'Cajuru 2315\'); e nobre vernalizado (\'Jonas\'). Para cada cultivar, foram isolados segmentos radiculares de bulbilhos cultivados in vitro. Esses explantes foram mantidos em cultura durante 60 dias em meio MS, adicionado de 4,5 \'mü\'M 2,4-D e 0,5 \'mü\'M iP para obtenção de calos. Os calos obtidos foram transferidos para meio MS suplementado com 8,8 \'mü\'M BAP e 0,1 \'mü\'M ANA, e avaliados quanto à freqüência de regeneração. Inicialmente, foram analisados diversos fatores durante a introdução dos bulbilhos e na obtenção de calo para cada cultivar. Esses resultados permitiram realizar testes para avaliar o potencial de regeneração dos calos obtidos, e a cultivar \'Jonas\' apresentou a melhor taxa de regeneração via organogênese indireta (84%), seguida da cultivar \'Amarante\' (52%), \'IAC 63\' e \'Cajuru\' (47%) e a cultivar que apresentou a menor taxa foi a \'Lavínia\' (30%). Foi analisada a dose letal de higromicina ou canamicina, testando concentrações crescentes visando identificar os níveis ótimos de uso como agentes seletivos para a transformação. As doses acima de 50 mg/L de higromicina ou 200 mg/L de canamicina foram letais ao cultivo de calos de todas cultivares. A cultivar \'Jonas\' foi utilizada para o estabelecimento do procedimento de transformação via A. tumefaciens LBA4404(pCAMBIA1303), empregando como repórter o gene uidA (\'beta\'-glucuronídase) para determinação da eficiência da transformação. Foi demonstrado que a cultivar foi a \'Jonas\' apresentou o melhor potencial de calogênese e de regeneração, sendo o meio de cultura proposto por Kondo, Hasegawa e Suzuki (2000) o melhor para regeneração das cultivares brasileiras. Além disso, as cultivares brasileiras de alho parecem ser passíveis de transformação via A. tumefaciens