Estudos da interação e toxicidade de agregados do peptídeo β-amiloide em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y - Cancelliero, Giulia Scarcella (2025)
Dois eventos críticos na patogênese da doença de Alzheimer (DA) são o acúmulo de agregados do peptídeo β-amiloide (Aβ) no meio extracelular e a hiperfosforilação da proteína neuronal associada a microtúbulos Tau. Oligômeros solúveis de Aβ (AβOs) são considerados as espécies mais neurotóxicas de Aβ e estão relacionados aos danos sináptico e mitocondrial, inflamação, além de outros eventos neurotóxicos. Em relação a Tau, evidências sugerem que sua fosforilação anormal ocorre pela desregulação da atividade de proteínas quinases e fosfatases, potencialmente induzida por agregados de Aβ. Os mecanismos moleculares envolvidos na toxicidade dos AβOs e seu impacto nos níveis de fosforilação de tau não são completamente compreendidos. Por isso, a padronização de modelos in vitro adequados para o estudo destes mecanismos ainda é necessária. Neste contexto, a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, tanto em seu estado proliferativo quanto diferenciado, tem sido amplamente utilizada, especialmente em estudos de neurotoxicidade e neuroproteção. Evidências indicam que métodos de diferenciação capazes de induzir mudanças morfológicas e funcionais típicas de neurônios maduros tornam essas células mais suscetíveis à toxicidade induzida por agregados de Aβ. Motivados pela diversidade de protocolos para diferenciação de células SH-SY5Y descritos, os quais podem resultar em propriedades morfológicas e funcionais distintas, realizamos uma revisão sistemática da literatura, com o objetivo de identificar as variáveis dos protocolos de cultivo e de diferenciação de células SH-SY5Y que mais influenciam nos desfechos de neurotoxicidade induzidos por agregados de Aβ. Nesta revisão, identificamos que na maioria dos artigos incluídos o relato de informações metodológicas é insuficiente, impactando na confiabilidade dos dados. Nossa meta-análise indicou que células SH-SH5Y expostas a Aβ tem sua capacidade de redução de MTT diminuída e, por meta-regressão, identificamos que a concentração e duração da exposição ao peptídeo Aβ influenciam significativamente o tamanho de efeito observado. Paralelamente, padronizamos um protocolo de diferenciação neuronal de células SH-SY5Y baseado na adição de ácido retinóico e BDNF, que resultou em células com características morfológicas e bioquímicas de neurônios humanos maduros. Utilizando este modelo, avaliamos a ligação dos AβOs às células por microscopia de fluorescência. Neste ensaio, observamos que AβOs se ligam tanto ao corpo celular quanto aos prolongamentos de células SH-SY5Y diferenciadas. Em seguida, avaliamos a toxicidade de AβOs neste modelo por meio de dois ensaios de viabilidade celular. No ensaio de MTT, o tratamento com AβOs (1-2 µM) indicou uma tendência a redução da viabilidade que não foi significativa. Já no ensaio com Iodeto de Propídeo e Hoechst, o tratamento com AβOs (2 µM) levou ao aumento de cerca de três vezes da quantidade de células mortas. Utilizando este mesmo modelo, avaliamos por Western blot a fosforilação de Tau induzida por AβOs e por ácido ocadaico, um inibidor de fosfatases. Neste ensaio, o tratamento com AβOs a 1 e 2µM induziu aumento de cerca de três e nove vezes, respectivamente, do nível de tau fosforilada. Nosso trabalho, utilizando duas abordagens em paralelo, permitiu determinar a abrangência do uso das células SH-SY5Y como modelo de neurotoxicidade e identificar as condições ótimas para sua utilização.