Caracterização do gene que codifica a enzima álcool desidrogenase (TcADH) e associação da sua baixa expressão com o fenótipo de resistência in vitro do Trypanosoma cruzi ao benzonidazol

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2007
Autor(a) principal: Campos, Fernanda Magalhães Freire
Orientador(a): Murta, Silvane Maria Fonseca, Romanha, Alvaro José
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/4037
Resumo: Álcool desidrogenases (ADH) pertencem a um grupo de enzimas que catalizam aoxidação reversível de etanol a acetaldeído, com conseqüente redução de NAD. O gene TcADHque codifica a ADH do T. cruzi, foi selecionado pela metodologia microarray por apresentarum nivel de transcrição 4 vezes menor na população do parasito com resistência induzida invitro ao BZ (17LER) quando comparado com seu par sensível (17WTS). A TcADH codificauma proteína de 393 aminoácidos que apresenta um domínio conservado iron-containingalcohol desidrogenase . A análise da estrutura primária mostrou que a TcADH é mais parecidacom as ADHs de organismos procariotos do que com seus ortólogos identificados emLeishmania. A atividade enzimática da TcADH foi menor nas cepas de T. cruzi com resistênciainduzida in vitro ao BZ (17 LER). Análises de Western blot mostraram que o anticorpopoliclonal anti-TcADH reconheceu um polipeptídeo de 41,7 kDa em todas as cepas do T. cruzianalisadas. O nível de expressão desse polipeptídeo foi 2 x menor na cepa do T. cruzi 17LERquando comparado com seu par 17WTS, confirmando os dados da atividade enzimática.Ensaios de imunolocalização por microscopia confocal revelaram que a enzima TcADH estápresente no cinetoplasto do parasito. Análise de Northern blot mostrou que a sonda do geneTcADH reconheceu um transcrito de 1,9 Kb com a mesma intensidade para todas amostras doT. cruzi analisadas com exceção da população 17LER que foi 2 vezes menor. Análisequantitativa por PCR em tempo real (qPCR) também mostrou um nível de mRNA 2,5 vezesmenor na população 17LER. Quantificação do número de cópias desse gene por qPCR, mostrouser o mesmo para todas as cepas do T. cruzi analisadas. Neste trabalho, o gene TcADH foicaracterizado pela primeira vez em T. cruzi e foi observado uma menor expressão da enzimaTcADH na população do T. cruzi com resistência induzida in-vitro ao BZ
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A TcADH codificauma proteína de 393 aminoácidos que apresenta um domínio conservado iron-containingalcohol desidrogenase . A análise da estrutura primária mostrou que a TcADH é mais parecidacom as ADHs de organismos procariotos do que com seus ortólogos identificados emLeishmania. A atividade enzimática da TcADH foi menor nas cepas de T. cruzi com resistênciainduzida in vitro ao BZ (17 LER). Análises de Western blot mostraram que o anticorpopoliclonal anti-TcADH reconheceu um polipeptídeo de 41,7 kDa em todas as cepas do T. cruzianalisadas. O nível de expressão desse polipeptídeo foi 2 x menor na cepa do T. cruzi 17LERquando comparado com seu par 17WTS, confirmando os dados da atividade enzimática.Ensaios de imunolocalização por microscopia confocal revelaram que a enzima TcADH estápresente no cinetoplasto do parasito. Análise de Northern blot mostrou que a sonda do geneTcADH reconheceu um transcrito de 1,9 Kb com a mesma intensidade para todas amostras doT. cruzi analisadas com exceção da população 17LER que foi 2 vezes menor. Análisequantitativa por PCR em tempo real (qPCR) também mostrou um nível de mRNA 2,5 vezesmenor na população 17LER. Quantificação do número de cópias desse gene por qPCR, mostrouser o mesmo para todas as cepas do T. cruzi analisadas. Neste trabalho, o gene TcADH foicaracterizado pela primeira vez em T. cruzi e foi observado uma menor expressão da enzimaTcADH na população do T. cruzi com resistência induzida in-vitro ao BZAlcohol dehydrogenases (ADH) belongs to a group of enzymes that catalyze the reversible oxidation of ethanol to acetaldehyde, with consequent reduction of NAD. The TcADH gene that codes for the T. cruzi ADH of, was selected by microarray methodology as presenting a transcription level 4 four-fold lower in the T. cruzi population with in vitro- induced resistance to BZ (17 LER) than in the wild-type (17 WTS). The TcADH codes a protein of 393 aminoacids that presents a conserved “iron-containing alcohol desidrogenase” domain. Analysis of the primary structure showed that the TcADH is more similar to the of ADHs of procariotes than ADHs of other organisms as Leishmania. Assays of enzymatic activity showed that TcADH activity was lower in 17LER than in 17WTS. Western blot analysis of T.cruzi protein extracts probed with anti- TcADH rabbit polyclonal serum revealed a 41.7 kDa polypeptide present in all samples. The level of this polypeptide was similar for all samples except to 17LER that was nearly two-fold lower than the wild-type 17 WTS. Assays imunolocalization by confocal microscopy showed that the TcADH enzyme is present in parasite. Northern blot analyses showed that TcADH levels were 2.0 times lower in 17LER than in 17WTS. Real- time PCR confirmed our finding that TcADH transcription levels were lower in 17 LER than in 17 WTS. In contrast, we detected no differences in TcADH trancription level among other T. cruzi samples. Using real- time PCR, we found that the number of TcADH gene copies was similar in all samples. This difference of expression was confirmed by the. Our data show that a decreased expression of the TcADH enzyme was found only in a T. cruzi population with induced in vitro resistance to BZ. In this work, the TcADH gene was characterized for the first time in T. cruzi and was observed a smaller expression of the TcADH enzyme in a T. cruzi population with in vitro-induced resistance to BZ.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.porTrypanosoma cruziCaracterização do gene que codifica a enzima álcool desidrogenase (TcADH) e associação da sua baixa expressão com o fenótipo de resistência in vitro do Trypanosoma cruzi ao benzonidazolCharacterization of the gene that codifies the enzyme alcohol dehydrogenases (TcADH) and association of its low expression with phenotype of resistance in vitro of the Trypanosoma cruzi to benzonidazoleinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisFundação Oswaldo Cruz. 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