Desenvolvimento de um kit baseado em amplificação isotérmica de DNA mediada por loop (LAMP-PCR) em único tubo para o diagnóstico da tuberculose pulmonar
Ano de defesa: | 2022 |
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Resumo: | A Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que afeta principalmente os pulmões, porém, pode acometer outros órgãos. A detecção precoce de um indivíduo com TB é fundamental e, diante desse cenário, ensaios moleculares baseados em PCR estão entre os mais promissores métodosde diagnósticos quando comparados aos utilizados na rotina (baciloscipia e cultura).A amplificação isotérmica de DNA mediada por Loop (LAMP) vem ganhando espaço nos estudos envolvendo diagnóstico de doenças infecciosas por possuir diversas vantagens. Consiste, basicamente, na amplificação e detecção isotérmica de fragmentos contendo o DNA alvo utilizando seis oligonucleotídeos diferentes, especialmente desenhados para amplificar oito regiões nogene de interesse. O presente estudo pretende desenvolver um protótipo de kit baseado na amplificação isotérmica de DNA mediada por Loop (LAMP) em único tubo eficiente na identificação da TB pulmonar, sendo produzido no Brasil. Para a avaliação do limite de detecção do kit, foi feita uma curva de diluição, inicialmente em água MilliQe, em seguida, em escarro. Ambas as curvas foram de fator 10, variando de 100pg/µL à 100ag/µL de DNA do Mtbda cepa de referência H37Rv. Os reagentes do LAMP passaram por um controle de qualidade com a finalidade de avaliar sua durabilidade e estabilidade, durante 3 meses, em uma temperatura semelhante a de geladeira (4ºC). O kit foi testado em amostra biológica de escarro de pacientes diagnosticados com tuberculose (Grupo TB) e pacientes portadores de qualquer outra doença (Grupo não TB) para avaliação de sensibilidade e especificidade. O limite de detecção em água MilliQ e emamostra de escarro sabidamente negativa foi de 1fg/uL e o kit se manteve estável durante os 3 meses na temperatura de 4ºC. Com relação ao desempenho do kit, foram obtidos valores de sensibilidade e especificidade, 98,28% e 95,56%, respectivamente. Devido a sua elevada sensibilidade juntamente ao bom limite de detecção obtido, o desenvolvimentode um protótipo de kit, com grande valor de diagnóstico, permitirá trazer a possibilidade de uma identificação do bacilo mais rápida e eficaz que contribuiráem uma maiordescoberta e casos e no auxílio aos métodos tradicionais para confirmação da doença. |
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Mello, Danyele Costa deMontenegro, Rosana de AlbuquerqueSchindler, Haiana CharifkerMelo, Fábio LopesMonteiro, Juliana Figuerêdo da Costa Lima SuassunaSchindler, Haiana Charifker2023-05-19T13:23:53Z2023-05-19T13:23:53Z2022MELLO, Danyele Costa de. Desenvolvimento de um kit baseado em amplificação isotérmica de DNA mediada por loop (LAMP-PCR) em único tubo para o diagnóstico da tuberculose pulmonar. 2022. 75 p. Dissertação, (mestrado)-Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2022.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/58498A Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que afeta principalmente os pulmões, porém, pode acometer outros órgãos. A detecção precoce de um indivíduo com TB é fundamental e, diante desse cenário, ensaios moleculares baseados em PCR estão entre os mais promissores métodosde diagnósticos quando comparados aos utilizados na rotina (baciloscipia e cultura).A amplificação isotérmica de DNA mediada por Loop (LAMP) vem ganhando espaço nos estudos envolvendo diagnóstico de doenças infecciosas por possuir diversas vantagens. Consiste, basicamente, na amplificação e detecção isotérmica de fragmentos contendo o DNA alvo utilizando seis oligonucleotídeos diferentes, especialmente desenhados para amplificar oito regiões nogene de interesse. O presente estudo pretende desenvolver um protótipo de kit baseado na amplificação isotérmica de DNA mediada por Loop (LAMP) em único tubo eficiente na identificação da TB pulmonar, sendo produzido no Brasil. Para a avaliação do limite de detecção do kit, foi feita uma curva de diluição, inicialmente em água MilliQe, em seguida, em escarro. 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Devido a sua elevada sensibilidade juntamente ao bom limite de detecção obtido, o desenvolvimentode um protótipo de kit, com grande valor de diagnóstico, permitirá trazer a possibilidade de uma identificação do bacilo mais rápida e eficaz que contribuiráem uma maiordescoberta e casos e no auxílio aos métodos tradicionais para confirmação da doença.Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb),which mainly affects the lungs, however, it can affect other organs.The early detection of anindividual with TB is essential and, given this scenario, molecular assays based on PCRare among the most promising diagnostic methods when compared to those used routinely.Loop-mediated isothermal DNA amplification (LAMP) has been gaining ground instudies involving the diagnosis of infectious diseases because it has several advantages. Itbasically consists of the isothermal amplification and detection of fragments containing the target DNA using six different oligonucleotides, specially designed to amplify eight regionsin the gene of interest.The present study intends to develop a prototype of a kit based onisothermal amplification of DNA mediated by Loop (LAMP) in a single tube efficient in theidentification of the several clinical forms of the disease, being produced in Brazil.For theevaluation of the detection limit of the kit, a dilution curve was made, initially in MilliQ waterand then in sputum. Both curves were factor 10, ranging from 100pg/µL to 100ag/µL of MtbDNA from the H37Rv reference strain.The LAMP reagents underwent quality control inorder to assess their durability and stability for 3 months at a temperature similar to that of arefrigerator (4ºC). The kit will be tested on biological sputum samples from patientsdiagnosed with tuberculosis (TB Group) and patients with any other disease (Non-TBGroup) to assess sensitivity and specificity.The detection limit in MilliQ water and in asputum sample known to be negative was 1fg/uL and the kit was stable for 3 months at atemperature of 4ºC. Regarding the performance of the kit, sensitivity and specificity values were obtained, 98.28% and 95.56%, respectively. Due to its high sensitivity together with a good detection limit, the development of a prototype kit, with great diagnostic value, willbring the possibility of a faster and more effective identification of the bacillus that willcontribute to a greater discovery of cases and help traditional methods for confirming thedisease.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.porTuberculoseKit de reagentes para diagnósticoMycobacterium tuberculosisTuberculosisDiagnostic reagent kitMycobacterium tuberculosisTuberculosisKit de reactivos de diagnósticoTuberculosis micobacterianaTuberculoseKit de réactifs de diagnosticMycobacterium tuberculosisTuberculose PulmonarTuberculoseKit de reagentes para diagnósticoMycobacterium tuberculosisReação em Cadeia da PolimerasemetodosmetodosTécnicas de Amplificação de Ácido NucleicoDNA BacterianoPrimers do DNAEscarroTécnicas de Diagnóstico MolecularDesenvolvimento de um kit baseado em amplificação isotérmica de DNA mediada por loop (LAMP-PCR) em único tubo para o diagnóstico da tuberculose pulmonarinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2022-10-14Instituto Aggeu MagalhãesFundação Oswaldo CruzMestrado AcadêmicoRecifePrograma de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia em Saúdeinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZORIGINALdanyele_mello_iam_mest_2022.pdfdanyele_mello_iam_mest_2022.pdfapplication/pdf5267153https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/58498/2/danyele_mello_iam_mest_2022.pdf73407049df148cfd5e2ee1fe05e0c931MD52LICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/58498/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51icict/584982023-05-19 10:23:54.976oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352023-05-19T13:23:54Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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