Otimização da RT-PCR Multiplex para detecção de vírus dengue em amostras de Aedes aegypti infectados artificialmente

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Barbosa, Priscilla Paschoal
• Orientador(a): Ayres, Constância Flávia Junqueira
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/14345
• topic: Aedes; Reação em Cadeia da Polimerase; Estabilidade de RNA; Vírus da Dengue; Aedes/virologia; Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real/métodos; Estabilidade de RNA; Vírus da Dengue/genética; Vírus da Dengue/isolamento & purificaçäo

A dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos, no que diz respeito à morbidade e mortalidade, que afeta os seres humanos. Este vírus é transmitido pelos vetores Aedes albopictus e Aedes aegypti, este último é o principal vetor nas Américas. O controle da doença se baseia na vigilância laboratorial e vigilância entomológica. A vigilância laboratorial visa aprimorar a capacidade do diagnóstico, detectando precocemente a circulação viral e monitorando os sorotipos circulantes. Dentro deste tipo de vigilância, a RT-PCR é um método bastante usado no diagnóstico da doença em humanos e mosquitos, porém, a má conservação do material pode comprometer a integridade do RNA e trazer resultados falso-negativos. O desenvolvimento de melhores métodos de vigilância do vírus dengue (DENV) em mosquitos é de grande valor para os programas de controle. Desta maneira, o presente projeto visou otimizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de DENV em amostras de Ae. aegypti infectadas artificialmente pelo vírus. Primers que amplificam uma região de 80 pb do gene rpL8 de mosquito foram desenhados no site Primer3 e avaliados na ferramenta online Multiple Primer Analyzer, junto com primers que amplificam os sorotipos DENV. Não houve competição de primers e foi observado bandas distintas no gel de agarose. Foi avaliado o efeito de diferentes formas de preservação do material genético das amostras (RNAlater®, freezer -80°C e nitrogênio líquido) por 7 dias, onde não houve diferenças significativas em relação à integridade do RNA. O efeito de diferentes formas de extração de RNA (Kit da QIAGEN®, TRIzol® e Chomczymski-Sacchi) também foi avaliado e o método ChomczymskiSacchi obteve o melhor desempenho. A otimização desta técnica permitirá uma maior confiabilidade nos resultados, já que além da detecção dos sorotipos, haverá uma confirmação da qualidade do RNA, aprimorando a capacidade do diagnóstico e auxiliando a prevenção e controle da transmissão da dengue.