Clonagem e expressão do gene da quitinase de Anopheles gambiae em Pichia pastoris

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Guimarães, Jander Matos
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/6023306624960304
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas; Instituto de Ciências Biológicas; Brasil; UFAM; Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
• Palavras-chave em Português: Enzimas; Anófele; Biologia molecular; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA: BIOLOGIA MOLECULAR; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA: ENZIMOLOGIA; Pichia pastoris; Enzima recombinante; Quitinase; Anopheles gambiae
• Link de acesso: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7286

Sendo integrante da classe das glicosídeo-hidrolases, as quitinases (EC 3.2.1.14) atuam na clivagem de sítios randômicos da molécula de quitina através de hidrólise, formando cadeias de quitooligossacarídeos. Estruturalmente possuem subdomínios catalíticos que a auxiliam na ligação ao seu substrato insolúvel e ruptura da conformação cristalina. O potencial enzimático dessas enzimas compreende principalmente o controle biológico de fito-patógenos fúngicos e insetos vetores, organismos onde a quitina é um componente estrutural da parede celular ou exoesqueletos. Entretanto, sua aplicabilidade se estende à síntese de polissacarídeos artificiais, isolamento de protoplastos fúngicos e estimativa de biomassa em processos industriais. A partir do sequenciamento do genoma de Anopheles gambiae foi obtido o gene atribuído a expressão de quitinase, de maneira que através de síntese química esse gene foi clonado em Escherichia coli (linhagem DH5α), e integrado ao genoma de Pichia pastoris nos vetores de expressão pPIC9 e pPICPGK. A atividade enzimática de 19 clones foi confirmada por análise do halo de degradação de quitina coloidal, e após a seleção foi realizada produção submersa em frascos agitados e caracterização bioquímica da enzima por delineamento central composto rotacional (DCCR). A clonagem e obtenção de vetores de expressão recombinantes foi consolidada de maneira que a integração ao genoma da levedura apresenta nível significante de expressão, na atividade enzimática fatores como tempo de incubação e temperatura não revelaram significância, e o fator pH se demonstrou com reposta positiva em faixas mais acídicas.