Estudo da capacidade de amplificação do sinal de fluorescência de anticorpos conjugados com nanopartículas de ouro detectado por citometria de fluxo.

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Daniela Silva dos Reis
• Orientador(a): Luiz Orlando Ladeira
• Banca de defesa: Ana Maria Caetano de Faria, Estefânia Mara do Nascimento Martins
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Inovação Tecnológica e Propriedade Intelectual
• Departamento: ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: Nanopartículas de ouro; Biofuncionalização; Citometria de fluxo; Citometria de fluxo com imagem acoplada; Fluorescência; Anticorpos primários e secundários; Ressonância plasmônica; Células A431; Cetuximabe e anti-CD44
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/48437; https://orcid.org/ 0000-0002-9554-593X

O uso de nanomateriais na área biomédica vem aumentando gradativamente com o aprimoramento das técnicas de síntese e funcionalização. Para que possa ser utilizado de maneira segura o nanomaterial dever ser altamente estável e baixa toxicidade. Neste trabalho foi proposto estudar a possibilidade de amplificação do sinal de fluorescência, utilizando baixas concentrações de anticorpos primários funcionalizados com nanopartículas de ouro (AuNP) e secundários também em concentrações diminutas e realizar o estudo sistemático da sua estabilidade e baixa toxicidade para as células. As AuNPs puras foram escolhidas por não emitem sinal de fluorescência após serem interceptadas por uma fonte luminosa, pela sua alta capacidade de absorção e transferência de energia e por não causar toxicidade para as células conhecidas e por ser altamente estável. Este trabalho envolveu as seguintes etapas: a) síntese das AuNPs pela rota do citrato de sódio; b) caracterização das AuNPs quanto ao tamanho e a morfologia; c) avaliação da viabilidade celular e ciclo celular; d) biofuncionalização das AuNPs com os anticorpos primários e secundários. Para isto, utilizou-se os anticorpos primários cetuximabe (CetIgG) e anti-CD44 (CD44IgG), para este último foi feita a identificação do seu ponto isoelétrico pela curva de variação do pH da solução e foram utilizados os anticorpos secundários Alexa Fluor®488IgG (AF488IgG) e Pe-CF594 IgG1 (Pe-CF594IgG. e) caracterização dos nanocomplexos formados; f) conjugação dos nanocomplexos com os anticorpos secundários; g) avaliação da ligação dos nanocomplexos aos anticorpos secundários; h) reconhecimento das moléculas-alvo presentes na membrana celular pelos nanocomplexos. Os espectros de UV-vis obtidos demonstraram a formação de nanopartículas de ouro, com banda plasmônica característica. Após a funcionalização com o CetIgG e CD44IgG , a espectroscopia UV-vis foi novamente realizada o que demonstrou sucesso neste procedimento pelos deslocamentos das curvas em relação as AuNPs puras. As AuNPs foram analisadas por microscopia eletrônica (MET) que demonstrou sua morfologia esférica. O estudo de estabilidade das AuNPs, foi realizado através das medições do espalhamento de luz dinâmico (DLS). O potencial zeta foi realizado para confirmar a estabilidade da emulsão coloidal. As AuNPs foram avaliadas antes e após a funcionalização com os anticorpos primários os resultados demostraram que as nanopartículas permaneceram dispersas. O teste de fluorimetria confirmar a funcionalização das AuNPs com CetIgG e CD44IgG , os resultados corroboram os dados obtidos pelo potencial zeta. Para confirmar a conservação do reconhecimento dos epítopos celulares e a amplificação pelos nanocomplexos AuNPCetIgG e AuNPCD44IgG a MET e a citometria de fluxo (CF) e citometria de fluxo com imagem (CFI) foram utilizadas. Os dados obtidos por estas técnicas demonstraram que, após, a funcionalização dos anticorpos primários com as AuNPs não houve prejuízo para reconhecimento e ligação aos receptores de membrana celular. Houve também o melhoramento da detecção do sinal em baixas concentrações pelos anticorpos secundários Alexa Fluor 488 (AF488IgG) e Pe-CF594IgG gerando resultados mais eficientes com espectros de emissões mais estreitos reduzindo a interferência em outros filtros e a redução dos custos da técnica de citometria de fluxo.