Estudo sobre a eletroporação de células biológicas com pulsos de curta duração e alta intensidade

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: William Perez Dias de Figueiredo
• Orientador(a): Jaime Arturo Ramirez
• Banca de defesa: Elizabeth Ribeiro da Silva, Danilo Barbosa Melges, Ivan Jose da Silva Lopes
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Palavras-chave em Português: Transporte molecular; Eletroporação; Membrana celular; Citometria de fluxo; Pulso elétrico
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9ZCHWE

Os objetivos desse trabalho foram construir um eletroporador portátil de células biológicas com pulsos na faixa de 100V a 900V de amplitude e 2$\mu$s a 100$\mu$s de duração e realizar estudos de viabilidade celular e avaliação do efeito desses pulsos sobre a entrada de moléculas fluorescentes em células LLC-MK2. O eletroporador foi concebido em três módulos: gerador de alta tensão c.c., módulo de controle e um módulo de chaveamento em alta tensão. O gerador de alta tensão c.c. foi construído com dobradores capacitivos, o módulo de controle foi construído com um PIC18F4550 e \textit{drivers} para controle de dispositivos semicondutores de potência e o módulo de chaveamento em alta tensão foi construído com capacitores e um IGBT de potência. O circuito eletroporador foi utilizado para gerar pulsos de 9kV/cm com duração variável de 2$\mu$s a 100$\mu$s e pulsos de 100$\mu$s com amplitude variável entre 1kV/cm e 9kV/cm em testes de viabilidade e eletroporação. Utilizou-se cubetas para eletroporação com distância de 1mm entre os eletrodos para submeter células LLC-MK2 em suspensão aos pulsos gerados. Os ensaios de viabilidade foram feitos utilizando a técnica colorimétrica com MTT. Nos testes de eletroporação, utilizou-se a técnica de citometria de fluxo para avaliar a entrada de moléculas de iodeto de propídio e FITC-Dextran de 20kDa(6,6nm de diâmetro) e 2MDa(54nm de diâmetro) no citoplasma das células. As células foram submetidas aos pulsos elétricos em meio no qual as moléculas de teste foram previamente adicionadas. Também foi realizado um experimento no qual as células foram submetidas aos pulsos em meio sem moléculas de teste e, 30 minutos depois, o iodeto de propídio foi adicionado à suspensão de células. O eletroporador foi capaz de gerar pulsos que causaram diferenças significativas tanto no percentual de células marcadas com fluoróforos quanto na viabilidade celular, com desempenho satisfatório. Nos testes de viabilidade, observou-se que os pulsos de 100$\mu$s e 5kV/cm ou 9kV/cm, ou 50$\mu$s e 9kV/cm reduziram a viabilidade para valores de até 20$\%$, revelando que esses pulsos são agressivos para o tipo celular estudado. A proporção de células marcadas com iodeto previamente adicionado ao meio de eletroporação chegou a percentuais de 80$\%$ para pulsos de 100$\mu$s e 9kV/cm. Para FITC-Dextran, os percentuais de células marcadas foram menores, variando entre 20$\%$ e 30$\%$ para o mesmo tipo de pulso, sem diferença estatística significante entre os tamanhos de 20kDa e 2MDa. Após um intervalo de 30 minutos, as células continuaram permeáveis ao iodeto de propídio, com diminuição percentual de células marcadas entre 25$\%$ e 30$\%$ em relação às células que foram expostas aos pulsos com iodeto previamente adicionado à suspensão de células. A falta de significância estatística no efeito desse intervalo, para pulsos de 100$\mu$s e 9kV/cm, indica que esse pulso teria efeitos mais duradouros. O aumento da amplitude de pulsos de 100$\mu$s diminuiu a viabilidade celular e aumentou as médias percentuais de células marcadas com moléculas fluorescentes. Já o aumento da duração de pulsos de 9kV/cm causou diminuição da viabilidade celular e aumento das médias percentuais de células marcadas com iodeto de propídio, mas não teve efeito sobre as médias percentuais de células marcadas com FITC-Dextran. Entre os dois tamanhos de FITC-Dextran, os percentuais de células marcadas foram estatisticamente similares, se diferenciando do percentual de células marcadas com iodeto de propídio. Observou-se que os pulsos utilizados diminuem muito a viabilidade celular ou são ineficientes para permitir a entrada das moléculas de teste no citoplasma das células. Um baixo percentual de células marcadas com FITC-Dextran foi obtido. Assim, os pulsos estudados seriam mais indicados para aplicações nas quais uma alta mortalidade celular associada à inserção de pequenas moléculas no citoplasma das células é desejada.