Desenvolvimento e aplicação de métodos bioquímicos e bioinformáticos para buscar interações regulatórias: Tead4 como modelo

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Elisa Renno Donnard Moreira
• Orientador(a): Jose Miguel Ortega
• Banca de defesa: Francisco Pereira Lobo, Gloria Regina Franco
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Palavras-chave em Português: Bioquímica e Imunologia
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9NMGMF

O método de duplo-híbrido em leveduras é um sistema de seleção genético que permite a identificação de produtos de cDNA que interagem com uma proteína de interesse. Neste trabalho descrevemos dois novos protocolos para triagem em meio líquido que contribuem para aperfeiçoar este valioso método e eliminam a triagem laboriosa em placas de meio sólido. Para validar os novos protocolos utilizamos duas linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae, KGY37 e Y190, três iscas diferentes: m-RTel1, m-Trim2 ou h- TRIM32 e suas bibliotecas de cDNA respectivas: testículo de camundongo, cérebro de camundongo e músculo esquelético humano. Estas combinações já haviam sido previamente triadas com o protocolo tradicional, permitindo uma comparação com o protocolo novo. A nova triagem resultou na seleção de interações em todos os ensaios, o número obtido de clones positivos é comparável ao meio sólido e o meio líquido se mostrou uma abordagem mais rápida, econômica e eficiente. Atualmente, são gerados dados de interações entre proteínas e regulações gênicas em larga escala. Para uma visualização melhor de processos biológicos complexos, é interessante que estes dados sejam integrados e disponibilizados em bancos de dados como KEGG Pathway. Para o desenvolvimento embrionário pré-implantação, não existe uma via regulatória e nem todos os genes envolvidos no processo sequer possuem entradas no banco KEGG Orthology. Em vista disso, procuramos desenvolver esta via regulatória utilizando ferramentas de mineração de texto como Medline Ranker e PESCADOR para revelar biointerações entre genes envolvidos neste processo. Após a criação da via, os genes encontrados foram também utilizados como seed no software SeedServer desenvolvido no laboratório para gerar agrupamentos de homólogos. Os homólogos permitiram também a determinação do último ancestral comum de cada gene, revelando que a via do desenvolvimento préimplantação é composta por uma porção ancestral e genes com origem moderna. Um dos fatores de transcrição essenciais para esta etapa do desenvolvimento é Tead4, envolvido em diversas regulações da pré-implantação. O único parceiro de interação conhecido para Tead4 é YAP que participa da regulação da diferenciação da trofectoderme. Em busca de novos parceiros que interagem com Tead4 utilizamos esta proteína como isca numa triagem de duplo-híbrido com o protocolo validado previamente. A biblioteca de cDNA utilizada foi a de embrião de sete dias (camundongo) e um dos clones recuperados no ensaio foi identificado como Tioredoxina1, cujo envolvimento em outras interações com fatores de transcrição é conhecido.