Regulação da atividade de NifA de H. seropedicae por proteínas PII em resposta aos níveis de amônio
Ano de defesa: | 2018 |
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Stefanello, Adriano Alves, 1990-Monteiro, Rose AdeleOliveira, Marco Aurélio Schüler deSouza, Emanuel Maltempi de, 1964-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)2019-10-09T19:52:00Z2019-10-09T19:52:00Z2018https://hdl.handle.net/1884/63665Orientadora: Profª. Drª. Rose Adele MonteiroCoorientadores: Prof. Dr. Marco Aurélio S. de Oliveira, Prof. Dr. Emanuel Maltempi de SouzaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 22/03/2018Inclui referências: p.172-202Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma B-proteobactéria diazotrófica endofítica encontrada em vasos xilemáticos de gramíneas de interesse econômico, como milho, trigo, e sorgo, onde contribui para aumentar o crescimento vegetal através da fixação de nitrogênio e da produção de fitormônios. Neste organismo, a fixação biológica de nitrogênio é regulada através do controle da expressão dos genes nif (que codificam a enzima nitrogenase e as demais proteínas necessárias à sua maturação) mediado pelo ativador transcricional NifA. Além de possuir sensibilidade intrínseca a oxigênio, NifA tem sua atividade reprimida na presença de íons amônio. Esta repressão é mediada por seu próprio domínio GAF N-terminal, possivelmente devido a interações diretas entre resíduos do GAF e do restante da proteína. A interação do domínio GAF com a proteína GlnK alivia a inibição de NifA pelo domínio GAF sob condições de baixa concentração de amônio, e a desrepressão parece requerer a ligação de GlnK a ATP e 2-oxo-glutarato (2OG) e a uridililação de GlnK por GlnD. Neste trabalho, utilizou-se o processo de mutagênese sítio-dirigida de glnK para testar a importância da uridililação e da interação desta proteína com seus efetores para a ativação de NifA. Realizou-se também a mutagênese aleatória de glnK para tentar localizar resíduos importantes para interação com NifA. Os resultados mostram que a capacidade de interação de GlnK com ATP é absolutamente essencial e a interação com 2OG é o principal requerimento para a ativação de NifA por GlnK. Diferente do observado em outros organismos, a uridililação de GlnK parece não ter efeito sobre a ativação de NifA. As substituições aleatórias inativadoras de GlnK concentraram-se na face superior do trímero de PII, próxima do T-loop, sugerindo ser esta a região responsável pela interação com NifA. Realizou-se também a construção de variantes quiméricas de NifA insensíveis a oxigênio para uso em experimentos de mutagênese aleatória, que permitiram identificar ao menos 26 substituições inativadoras localizados entre os resíduos 14-164 de NifA e 11 substituições ativadoras concentradas entre os resíduos 176-193. A distribuição espacial e a identidade das substituições, somada à caracterização do estado de oligomerização da proteína quimérica utilizada nos experimentos, levaram a propor um mecanismo de regulação de NifA por controle do estado de oligomerização, análogo ao observado em Nlh1 de Aquifex aeolicus. Palavras-chave: NifA, Herbaspirillum seropedicae, fixação biológica de nitrogênio.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is an endophytic diazotrophic B-proteobacterium found in the xylem vessels of economically important grasses, such as maize, wheat, and sorghum, where it supports plant growth through nitrogen fixation and phytohormone production. In this organism, biological nitrogen fixation is regulated by the transcriptional activator NifA, which controls the expression of the nif genes (which encode the nitrogenase enzyme and the other proteins necessary for its maturation). In addition to having intrinsic oxygen sensitivity, NifA has its activity repressed in the presence of ammonium ions. This repression is mediated by its own N-terminal GAF domain, possibly due to intramolecular interactions between residues in the GAF and the rest of the protein. The interaction of the GAF domain with GlnK alleviates NifA inhibition under conditions of low fixed nitrogen, and NifA derepression seems to require the binding of GlnK to ATP and 2-oxo-glutarate (2OG), and the uridylation of GlnK by GlnD. In this work, site-directed mutagenesis of glnK was used to test the importance of uridylation and the importance of GlnK interaction with ATP and 2OG for the activation of NifA. Random mutagenesis of glnK was also performed to try to locate residues important for protein-protein interaction. The results show that the interaction of GlnK with ATP is absolutely essential and the interaction with 2OG is the main requirement for the activation of NifA by GlnK. Unlike in other organisms, the uridylation of GlnK appears to have no effect on the activation of NifA. Random substitutions inactivating GlnK were concentrated on the upper face of the PII trimer, near the T-loop, suggesting this surface to be the region responsible for interaction with NifA. Oxygen-insensitive NifA chimeric variants were also constructed to be used in random mutagenesis experiments, which allowed the identification of at least 26 inactivating substitutions located between residues 14-164 of NifA and 11 activating substitutions concentrated between residues 176-193. The spatial distribution and identity of the substitutions, together with the characterization of the chimeric protein's oligomerization state in solution, led to the proposal of control of the oligomerization state as a mechanism of NifA regulation, similar to what was proposed for Aquifex aeolicus Nlh1. Key-words: NifA, Herbaspirillum seropedicae, biological nitrogen fixation.225 p. : il. (algumas color.).application/pdfNitrogênio - FixaçãoHerbaspirillumBioquímicaRegulação da atividade de NifA de H. seropedicae por proteínas PII em resposta aos níveis de amônioinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - ADRIANO ALVES STEFANELLO.pdfapplication/pdf23715283https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/63665/1/R%20-%20T%20-%20ADRIANO%20ALVES%20STEFANELLO.pdfc797c7b106a97d5c37cf57cf106f61a0MD51open access1884/636652019-10-09 16:52:00.698open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/63665Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082019-10-09T19:52Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false |
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