Transcriptional modulation and characterization of plant-specific trans-acting factors in abiotic stress responses

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Melo, Bruno Paes de
• Orientador(a): Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Programa de Pós-Graduação: Bioquímica Aplicada
• Área do conhecimento CNPq: Bioquímica Molecular
• Link de acesso: https://locus.ufv.br//handle/123456789/29433

Fatores de transcrição (FTs) são reguladores centrais da expressão gênica nas células. Devido à sua plasticidade funcional e ao seu papel como protagonistas no controle da expressão gênica de acordo com o ambiente, podem ser considerados hot spots para decifrar os mecanismos de resposta das plantas a múltiplos estresses e alvos adequados para intervenção biotecnológica e desenvolvimento de plantas adaptadas. Diversas famílias de fatores de transcrição de plantas são relacionados as respostas ao estresse, incluindo NAC, MYB, WRKY e bZIP. O presente trabalho explora a funcionalidade de AREB-1, um FT da família bZIP em Arabidopsis, extensivamente caracterizado caracterizado nas adaptações fisiológicas em resposta ao estresse hídrico, além da superfamília NAC de soja e seus membros associados ao controle de respostas múltiplas ao estresse e senescência. No primeiro capítulo, apresentamos uma nova estratégia de modulação da transcrição de AREB-1 por CRISPR/dCas9 em Arabidopsis para tolerância à seca. Os capítulos a seguir lidam com novas idéias acerca da superfamília GmNAC e estudos funcionais de GmNAC065 e GmNAC085 com base em análises genômicas e transcritômicas, além de uma abordagem de genética reversa em Arabidopsis. Utilizando a técnica de ativação CRISPR (CRISPRa), uma nuclease inativa dCas9 foi fundida com uma histona acetil-transferase 1 (AtHAT1), otimizando a expressão gênica via remodelação da cromatina. A superexpressão de AREB1 mediada por CRISPRa promoveu uma melhora no desempenho fisiológico das plantas transgênicas em 30 dias de privação de água. O fenótipo de maior tolerância à seca foi associado ao aumento do conteúdo de clorofila, atividade de enzimas antioxidantes e conteúdo de açúcar solúvel, com consequente menor acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROS). Finalmente, demonstramos que a regulação positiva de AREB1 alterou positivamente a transcrição de genes induzíveis ABA downstream envolvidos na resposta adaptativa e promoveu um melhor desempenho da planta sob seca, validando o CRISPRa como uma ferramenta biotecnológica para melhorar características específicas desejáveis em plantas. Os genes NAC codificam TFs envolvidos no controle damorfofisiologia da planta e respostas ao estresse. A última montagem do genoma da soja (Wm82.a2.v1) levantou a possibilidade de novos genes NAC no genoma da soja. Nesta investigação, identificamos 32 novos genes NAC putativos, atualizando a superfamília para 180 membros de genes, agrupados em 15 subfamílias filogenéticas. Mostramos que 40% dos GmNACs são regulados diferencialmente pela senescência do desenvolvimento. GmNAC065 e GmNAC085 apresentam perfis de expressão gênica contrastantes em múltiplas respostas de estresse e induzem sintomas de senescência foliar em diferentes extensões quando expressos transientemente em N. benthamiana, sugerindo um papel divergente para esses genes. Posteriormente, o genoma da soja foi interrogado para genes associados à senescência desencadeada por estresse e de desenvolvimento (SAGs) pertencentes à superfamília NAC. Usando SAGs de Arabidopsis funcionalmente caracterizados como protótipos, identificamos os NAC- SAGs putativos em soja, incluindo GmNAC065 e GmNAC085, cujas funções em múltiplas respostas ao estresse e senescência foram investigadas em soja e linhagens transgênicas de Arabidopsis. A expressão ectópica de GmNAC065 em Arabidopsis leva a um fenótipo de senescência retardada, com desempenho oxidativo aprimorado sob estresse múltiplo e menor morte celular induzida por estresse. As linhas que expressam GmNAC085 exibiram um fenótipo oposto levando à regulação positiva de vários SAGs, reforçando ainda mais seus papéis divergentes nas respostas ao estresse e morte celular programada. Finalmente, se quisermos usar a soja como sistema modelo para estudos genéticos e desenvolvimento de novas cultivares, precisamos desenvolver um protocolo eficiente para a transformação e regeneração da soja. O capítulo final deste trabalho propõe uma nova metodologia para a transformação genética da soja combinando a biolística e a transformação mediada por Agrobacterium. Desenvolvemos um protocolo de uma etapa para a recuperação da soja transgênica em aproximadamente 30 a 40 semanas de maneira mais econômica e explorando de forma direta a alta capacidade regenerativa das células do meristema apical no eixo embrionário. O protocolo permite o co-cultivo direto e a regeneração da planta, evitando a contaminação gerada pela excessiva manipulação de tecidos, exigida em outros protocolos. Portanto, estamos agora mais bem preparados para transpor os estudos fundamentais desenvolvidos nesta investigação em produtos biotecnológicos na obtenção de cultivares superiores. Palavras-chave: Fatores de transcrição. Melhoramento moderno de plantas. Estresses ambientais. Senescência. Engenharia genética de plantas.