Aprimoramento do diagnóstico de Leishmaniose visceral canina por ELISA usando o antígeno NTPDase-2 de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e padronização do diagnóstico por imunocromatografia

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Souza, Anna Cláudia Alves de
• Orientador(a): Fietto, Juliana Lopes Rangel
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Área do conhecimento CNPq: Biologia Molecular
• Link de acesso: https://locus.ufv.br//handle/123456789/28587

A leishmaniose visceral canina (LVC), causada pela Leishmania infantum chagasi é foco de diversos estudos, devido à relevância do cão como reservatório. No Brasil, a eutanásia de cães infectados é usada como controle da doença, orientada pelas técnicas de RIFI e ELISA. Porém estas técnicas apresentam limitações, que justificam o aprimoramento do diagnóstico. Em um trabalho prévio do nosso grupo, a proteína recombinante NTPDase-2 de L. infantum chagasi foi usada como antígeno em ensaios de ELISA, mostrando bom potencial para esta aplicação. O objetivo deste trabalho foi aprimorar o diagnóstico por ELISA. Para isto, foi feita a purificação manual e automatizada (FPLC). As purificações manuais forneceram maior grau de pureza e o processo em FPLC forneceu maior rendimento. Assim, várias purificações foram testadas, a fim de obter alto grau de pureza em sistema automatizado. Novos ELISAs foram realizados usando diferentes quantidades de antígeno (0,1 – 0,5 µg), diferentes diluições do soro de cães positivos e negativos (1:40; 1:80 e 1:160) e diferentes substratos de desenvolvimento de cor (TMB e OPD) para revelação. A influência da conformação do antígeno foi avaliada usando-o em condição nativa ou desnaturada. Na padronização do ELISA, 0,1 µg de antígeno e diluição do soro 1:160 foram as melhores condições. O uso de TMB e OPD não geraram diferenças significativas. Além disto, o antígeno renaturado também não levou à diferença significativa, indicando que o reconhecimento antígeno x anticorpo independente da conformação do antígeno. Quanto às purificações em FPLC, a melhor foi obtida usando 0,5 pellet bacteriano referente a 400 mL de indução, que forneceu grau de pureza de 96,6%. Além disso, foram feitos testes preliminares para a padronização deste antígeno em testes imunocromatográfcos. Foram padronizadas as conjugações da Proteína A e anti-IgG de cão a ouro coloidal de 40 nm. Para a linha controle, foi padronizada a concentração 2,5 µg/µL de IgG de cão na membrana de nitrocelulose e diluição do conjugado de 5x. Nossos dados confirmam que a NTPDase-2 tem potencial para o diagnóstico da LVC e que é possível melhorar os níveis de detecção de anticorpos variando as condições do ensaio. Além disto, foi possível iniciar a padronização de um teste imunocromatográfico que poderá futuramente trazer nova alternativa para o diagnóstico da LVC.