Caracterização cinético - bioquímica e aplicações biotecnológicas de α-galactosidases de Debaryomyces hansenii UFV-1

• Ano de defesa: 2005
• Autor(a) principal: Viana, Pollyanna Amaral
• Orientador(a): Guimarães, Valéria Monteze
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Área do conhecimento CNPq: Ciências Biológicas
• Link de acesso: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/8803

Diversas pesquisas têm demonstrado o potencial de α-galactosidases para o processamento de produtos alimentícios à base de leguminosas. A soja, uma fonte concentrada de isoflavonas, tem sido utilizada na prevenção e tratamento de câncer e osteoporose. Além disso, o leite de soja é considerado um substituto de baixo custo para o leite de vaca, como suplemento nutritivo para crianças intolerantes à lactose. Em contrapartida, leguminosas contêm muitos fatores antinutricionais, sendo um deles os oligossacarídeos de rafinose (RO), que são os principais fatores responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja. As mucosas intestinais de humanos e de animais monogástricos não possuem a enzima α-galactosidase, essencial para a hidrólise de ligações α-1,6 nos RO. Portanto, a eliminação dos RO dos produtos de soja contribui para melhorar o seu valor nutritivo. Esses galacto- oligossacarídeos são extremamente termoestáveis e, práticas tradicionais como embebição, cozimento e germinação são incapazes de eliminá-los completamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a hidrólise de RO presente no extrato desengordurado de soja e nos produtos de soja, melaços leve e pesado utilizando α-galactosidases extra e intracelulares purificadas de Debaryomyces hansenii, além da enzima extracelular imobilizada. Debaryomyces hansenii foi cultivada em meio mineral com extrato de levedura (MME), contendo galactose como fonte de carbono, por 36 h a 30 o C. Após este período, o meio de cultura foi centrifugado, o sobrenadante foi utilizado como fonte da enzima extracelular e as células como fonte da enzima intracelular. Os extratos enzimáticos foram submetidos à cromatografia de filtração em gel Sephadex G- 150 e posteriormente, à cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, pH 5,5. As frações protéicas com atividade de α-galactosidase foram eluídas com um gradiente de NaCl de 0 a 1 M. As enzimas extra e intracelulares apresentaram fatores de purificação de 16,7 e 289 vezes, respectivamente, com um rendimento de 58 e 45 %, respectivamente. Atividades máximas das α-galactosidases extra e intracelulares foram detectadas em pH 5,0, a 60 e 55 o C, respectivamente. A enzima extracelular manteve 80 % da atividade original após pré-incubação por 3 h a 60 o C, enquanto que, a enzima intracelular manteve 85 % da atividade original por 6 h a 55 o C. Os valores da K M para ρ-NP-αGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a enzima extracelular foram 0,30, 2,01, 9,66 e 16,0 mM, respectivamente, e para a enzima intracelular foram 0,32, 2,12, 10,8 e 32,8 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade absoluta para galactose em posição α, hidrolisando ρ-NP-αGal, estaquiose, rafinose, melibiose e os polímeros goma de alfarroba e goma guar. As α-galactosidases foram completamente inibidas por sulfato de cobre. A enzima extracelular foi completamente inibida por nitrato de prata, enquanto que, a atividade da enzima intracelular foi reduzida em 70 %. Na presença do substrato ρ-NP-αGal a enzima extracelular apresentou inibição não-competitiva por galactose (Ki 2,7 mM) e melibiose (Ki 1,2 mM). A enzima intracelular apresentou inibição do tipo acompetitiva por galactose (Ki 0,70 mM) e inibição competitiva por melibiose (Ki 0,98 mM). O N-terminal da α-galactosidase extracelular foi determinado por seqüenciamento automático (YENGLNLVPQMGWN), apresentando similaridade com α-galactosidases de outros microrganismos. A α-galactosidase extracelular foi imobilizada em suporte insolúvel (sílica modificada) e apresentou maior estabilidade comparada à enzima livre, mantendo 94 % de sua atividade original por 16 h a 70 o C. Os resultados dos tratamentos do leite de soja a 60 o C com a α- galactosidase extracelular purificada, com as células permeabilizadas contendo a enzima intracelular e com a enzima extracelular imobilizada, por 2, 2 e 4 h, respectivamente, mostraram redução de 100 % de estaquiose. Houve 100 % de redução de rafinose, com a enzima extracelular e com as células permeabilizadas, após 2 e 4 h, respectivamente. O tratamento do leite de soja com a enzima extracelular imobilizada por 10 h, promoveu redução de 63 % de rafinose. Após tratamento com a α-galactosidase extracelular a 60 o C, os produtos melaços leve e pesado, mostraram 100 % de redução de estaquiose após 2 h de incubação e rafinose foi reduzida em 60 e 50 %, respectivamente. Portanto, observa-se que as α-galactosidases de Debaryomyces hansenii foram eficientes na redução dos RO presentes em produtos derivados de soja, sendo indicadas para a utilização industrial no processamento desses açúcares.