Begomovirus-host protein-protein interaction network: identifying an intracytoplasmic route for viral DNA intracelular transport

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Mageste, Bianca Castro Gouveia
• Orientador(a): Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Programa de Pós-Graduação: Genética e Melhoramento
• Área do conhecimento CNPq: Biologia Molecular
• Link de acesso: https://locus.ufv.br//handle/123456789/30184

Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios e, uma vez no citoplasma da célula hospedeira, devem mover-se intracelularmente para e do local de replicação para a membrana plasmática para disseminação. Entender como os vírus sequestram o sistema de transporte intracelular do hospedeiro usando um repertório limitado de proteínas fornece uma oportunidade para descobrir as bases moleculares da maquinaria de transporte do hospedeiro. O begomovírus, um vírus ssDNA de planta, usa duas proteínas de movimento, MP e NSP, para mover-se intracelularmente do local de replicação no núcleo para a superfície da célula. No entanto, os componentes do hospedeiro do complexo de vDNA para a translocação intracitoplasmática não foram identificados, e o mecanismo subjacente para o tráfego intracitoplasmático de vDNA continua a ser elucidado. Neste trabalho, usamos um microarranjo de proteínas sintetizadas in situ, previamente produzido, contendo 4600 ORFs de Arabidopsis para identificar as interações proteína-proteína (PPIs) de NSP e MPArabidopsis. Consistente com a função de movimento das proteínas virais, a rede NSP-MP-PPI identificou interações diretas e indiretas, sobre-representadas sob os termos ontologia de atividade de transporte, ligação de proteína, organelas ligadas a membrana vesícula intracelular e complexo SNARE, que pode definir uma rota intracelular para o tráfico de vDNA. Esses estudos forneceram uma estrutura crítica para investigações futuras para elucidar os mecanismos moleculares para o transporte intracitoplasmático de begomovírus. Com base nesta suposição, selecionamos uma proteína contendo o domínio syntaxin-6 que interage especificamente com a NSP, designada NISP para posterior caracterização. Fornecemos várias linhas de evidência indicando que a NISP pode estar envolvida no direcionamento do movimento anterógrado intracitoplasmático do NSP-vDNA. Primeiro, usamos ensaios de coimunoprecipitação e ensaio de complementação de fluorescência bimolecular para confirmar que NISP interagiu com NSP in planta e mostramos que a formação do complexo ocorreu em vesículas de tráfego provavelmente associadas à rede transGolgi (TGN) / endossomo inicial. Segundo, mostramos que NISP exibia uma função pró-viral e a infecção por begomovírus exigia a interação NIPS-NSP. O mutante nisp-l era resistente a begomovírus, uma vez que as linhagens nocautes apresentavam sintomas atenuados, um atraso no curso da infecção e acumulavam muito menos DNAviral em comparação com as linhagens superexpressando e Col-0. Esse fenótipo de resistência de nisp-1 foi revertido pela complementação da NISP, confirmando que o fenótipo nisp-1 foi devido à inativação do gene NISP. Em contraste, as linhagens de superexpressão eram hipersensíveis aos begomovírus, pois apresentavam um curso acelerado de infecção e aumento da carga de DNA viral em comparação com Col-0. Aproveitamos um parálogo NISP altamente conservado, AT2G18860, para mostrar que a interação NISP-NSP ressaltou as bases moleculares para a função pró-viral do NISP. O AT2G18860, que partilha com o NISP um domínio de sintaxina-6 com 78.6% de identidade, não interage com o NSP e não interfere na infecção por begomovírus. Consistente com esses dados, NISP, mas não AT2G18860, foi induzido pela infecção por begomoviírus. Terceiro, a NISP também demonstrou interagir com NIG, o que facilita a liberação do complexo NSP-DNA dos poros nucleares para o citosol, e a presença de NSP aumentou a formação do complexo NISP-NIG. Usamos o teste ChIP para demonstrar que a NISP também estava associada ao vDNA em células infectadas, que podem ser transportado em um complexo multiproteico NISP-NIG-NSP. Finalmente, as interações com NISP realocaram o NIG citosólico disperso e NSP viral para a vesícula de tráfego provavelmente associada ao TGN/microssomas; desse modo, favorecendo a interação de NSP-DNA com MP, que mostrou ligar-se a SYTA associado a microssomas para o movimento de vDNAcélula-a-célula mediada por MP