Insights into regulatory mechanisms of the NIK-mediated antiviral defense: new components and the molecular bases of the defense

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Machado, João Paulo Batista
• Orientador(a): Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Área do conhecimento CNPq: Bioquímica; Biologia Molecular
• Link de acesso: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/6505

A proteína NIK (NSP-interacting kinase), identificada por interagir com a proteína NSP (nuclear shuttle protein) de geminivírus, apresenta características estruturais, bioquímicas e biológicas condizentes com um autêntico receptor cinase envolvido na resposta de defesa à infecção por geminivírus. A ativação deste receptor imune resulta na fosforilação da proteína ribossomal L10 (RPL10) e na subsequente relocação nuclear desta proteína ribossomal. Apesar dos avanços obtidos com a identificação de RPL10, outras conexões moleculares que ligam a ativação de NIK à resposta antiviral ainda são desconhecidas, bem como a natureza deste mecanismo de defesa. Nesta investigação, foi identificado um novo componente efetor downstream da via de sinalização mediada por NIK, um fator de transcrição denominado LIMYB (L10-Interacting Myb domain-containing protein), isolado pela sua capacidade de interagir com RPL10 pelo sistema de duplo híbrido em leveduras. Ensaios de co-imunoprecipitação e de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) mostraram que o complexo RPL10-LIMYB ocorre estavelmente na planta, mais precisamente no núcleo das células vegetais. Estudos de caracterização funcional mostraram que LIMYB atua como um autêntico fator de transcrição, ligando-se ao promotor e inibindo a expressão de genes de proteínas ribossomais. Estes resultados sugerem que o mecanismo de defesa antiviral mediado por NIK baseia-se na supressão da tradução do hospedeiro. Para examinar esta hipótese, inicialmente foi avaliado os níveis de tradução em linhagens de tomate superexpressando um mutante superativo de AtNIK1 (T474D). Os resultados mostraram que as linhagens transgênicas apresentaram menor acúmulo de proteínas recentemente sintetizadas quando comparadas com plantas WT. Posteriormente, as linhagens de tomate superexpressando T474D foram infectadas com duas espécies de begomovírus altamente divergentes, ToYSV (Tomato yellow spot virus) e ToSRV (Tomato severe rugose virus). As linhagens transgênicas apresentaram sintomas atenuados ou foram assintomáticas. Estas observações foram associadas com um atraso na infecção viral, com taxas de infecção menores e com a redução no acúmulo de DNA viral em folhas sistêmicas infectadas. Apesar do fenótipo de tolerância exibido pelas linhagens superexpressando T474D e dos menores índices de síntese proteica, estas linhagens não apresentaram diferenças no desenvolvimento, no desempenho fisiológico e nas características horticulturais quando comparadas com plantas WT ou com linhagens superexpressando AtNIK1. Finalmente, foi determinado se a redução nos níveis de tradução global do hospedeiro causado pela superexpressão de T474D poderia prejudicar a síntese de proteínas virais. Para isto, frações polissomais foram isoladas a partir de linhagens WT e T474D infectadas com ToYSV e a presença de mRNA viral foi examinada nestas frações. Os resultados mostraram uma menor associação do mRNA que codifica a proteína do capsídeo viral nas frações de polissomos de linhagens T474D quando comparadas àquelas de linhagens não transformadas. Coletivamente, estes resultados indicam que begomovírus não são capazes de manter altos níveis de tradução de mRNA virais nas linhagens superexpressando o mutante T474D, indicando que a supressão global da síntese de proteínas, identificada nestes genótipos, pode proteger eficientemente as células contra a infecção por estes vírus. Entretanto, estudos da variação global na expressão gênica de plantas nik1 alelos nulos mostraram que a perda da função de NIK1 promoveu a indução de componentes do hub principal da sinalização a brassinosteróide e de hubs envolvidos na sinalização ao ácido salicílico e na imunidade antibacteriana. Estes resultados sugerem que NIK1 pode funcionar como um regulador negativo em vias de sinalização de desenvolvimento e imunidade, apesar de sua propriedade antiviral.