Detecção de contaminação bacteriana em bolsas de plaquetas por método de amplificação molecular

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Jacqueline Duarte Viana
• Orientador(a): José Eduardo Levi
• Banca de defesa: João Renato Rebello Pinho
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade de São Paulo
• Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical
• País: BR
• Link de acesso: https://doi.org/10.11606/D.99.2018.tde-03052018-092801

Entre os casos de transmissão de agentes infecciosos por transfusão, a contaminação bacteriana ocupa o primeiro lugar no número de eventos, morbidade e mortalidade. Isto ocorre principalmente em transfusões de concentrados de plaquetas, que são armazenados à temperatura ambiente e sob agitação constante, condições propícias ao crescimento bacteriano. A cultura automatizada é adotada por alguns bancos de sangue para detecção de contaminação bacteriana, mas a um custo elevado, e oferecendo tempo inadequado na realização frente ao curto período de validade dos concentrados de plaquetas, de apenas 5 dias. Recentemente, alguns grupos vem avaliando a utilização de métodos de amplificação molecular, como um ensaio de PCR em tempo real baseado no gene de RNA ribossômico (16S RNAr), um método prático, uma vez que um par de iniciadores/sonda permite a detecção da mais ampla gama de bactérias. O objetivo do nosso trabalho foi estabelecer um método semi-automatizado de amplificação de DNA para a triagem universal de bactérias em concentrados de plaquetas. Concentrados de plaquetas foram contaminados com suspensões de cinco bactérias diferentes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae e Serratia marcescens, em 1 e 10 unidades formadoras de colônia (UFC)/mL, simulando a contaminação que ocorre durante a doação de sangue. Os concentrados de plaquetas foram armazenados à temperatura ambiente sob agitação durante 5 dias e alíquotas de 1 mL foram colhidas a cada 24 horas. A presença de bactérias foi investigada por PCR em tempo real e pelo ensaio eBDS (Enhanced Bacterial Detection System, PALL) como um método de referência. O DNA foi extraído no sistema automatizado MagNA Pure 96 (Roche). A amplificação por PCR em tempo real foi realizada com um conjunto de iniciadores universais e sonda alvo do gene de 16S RNAr em paralelo a um alvo de DNA mitocondrial como controle interno. A mistura de amplificação foi tratada com etídio-monoazida (EMA) seguido por fotoativação, para eliminar a contaminação com DNA bacteriano em reagentes. Com o PCR em tempo real foi possível detectar a presença de todas as espécies bacterianas testadas com uma concentração inicial de 10 UFC/mL 24 horas após a contaminação, com exceção de Staphylococcus hominis. Além disso, detectou-se a presença das bactérias Staphylococcus aureus, Serratia marcescens e Enterobacter cloacae com uma concentração inicial de 1 UFC/mL. Durante o período de estudo foram realizados 26.728 testes eBDS, com 9 resultados positivos. 800 amostras foram testadas simultaneamente pelo eBDS e PCR em tempo real, apenas uma das amostras contaminadas estava entre as testadas por ambos os testes. A incidência da contaminação bacteriana de CPs foi de 1:2.969, semelhante a outros trabalhos. Os resultados do teste molecular podem ser obtidos em 4 horas. O ensaio de PCR em tempo real pode ser uma boa alternativa aos métodos convencionais de cultura na triagem de contaminação bacteriana em concentrados de plaquetas, permitindo a detecção de bactérias, mesmo com uma quantidade inicial baixa de microrganismos, apresentando boa sensibilidade e resultados rápidos.