Otimização de um plasmídeo vacinal por introdução de elementos de direcionamento nuclear a ser veiculado por Lactococcus lactis

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Camila Prósperi de Castro
• Orientador(a): Anderson Miyoshi
• Banca de defesa: Alvaro Cantini Nunes, Débora de Oliveira Lopes
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Palavras-chave em Português: Genética
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8U4L79

Lactococcus lactis, a bactéria láctica modelo, é considerada segura e vem sendo há muito utilizada para produção e entrega de antígenos e citocinas às superfícies de mucosas. Mais recentemente, os estudos envolvendo este microorganismo têm também focado em sua utiilização como veículo para entrega de vacinas de DNA, plataforma vacinal inovadora que envolve a administração de um vetor plasmideano de expressão eucariótica capaz de codificar proteínas imunogênicas ou imunomoduladoras e que apresenta grande potencial como agente profilático e terapêutico. Todavia, a despeito das metodologias de entrega de vacinas de DNA até o momento desenvolvidas apresentarem relativa eficiência na entrega dos plasmídeos vacinais às células hospedeiras, estas são falhas em direcioná-los para o núcleo celular, evento crucial para que a ORF de interesse seja expressa e a vacina de DNA desempenhe sua função. Considerando que o envelope nuclear constitui o maior obstáculo à entrada dos plasmídeos vacinais no núcleo das células alvo, a otimização do direcionamento destes para o núcleo, bem como a transposição desta barreira é de fundamental importância para a eficácia de uma vacina gênica. Com o objetivo de melhorar os níveis de importação nuclear e de expressão gênica a partir de um plasmídeo vacinal desenvolvido por nosso grupo de pesquisa (pValac; Vaccination using lactic acid bacteria), a ser entregue especificamente por uma linhagem invasiva de L. lactis, este trabalho procurou otimizá-lo através da inserção de uma sequência nucleotídica do vírus símio 40 (SV40, do inglês Simian Virus 40), descrita como sendo capaz de direcionar DNA exógeno ao núcleo de células eucarióticas e aumentar a expressão gênica a partir dos plasmídeos que a contenham. Esta sequência, denominada Sequência de Endereçamento Nuclear (DTS, do inglês DNA nuclear Targeting Sequence), foi clonada no vetor pValac e para avaliação da funcionalidade desta construção, a ORF da proteína verde fluorescente (GFP, do inglês Green Fluorescent Protein) foi utilizada como repórter. A avaliação da funcionalidade da construção final pValac::DTS::gfp se deu por meio de sua transfecção em células mamíferas e análises através de microscopia de fluorescência e RT-PCR. Para efeito de comparação entre a expressão de GFP a partir do plasmídeo pValac::DTS::gfp e do plasmídeo controle pValac::gfp, foram realizados ensaios de Citometria de Fluxo. Os resultados mostraram que a presença da DTS no plasmídeo pValac::gfp não foi capaz de aumentar a expressão da proteína GFP, resultados estes que estão em desacordo com a maioria daqueles reportados pela literatura.