Identificação e caracterização parcial de antígenos isolados de vacinas contra Leishmaniose tegumentar americana (Leishvacin )

• Ano de defesa: 2002
• Autor(a) principal: Wanderley Almeida Ferreira
• Orientador(a): Carlos Alberto Pereira Tavares
• Banca de defesa: Alfredo Miranda de Goes, Ricardo Jose Alves, Luiz Carlos Crocco Afonso, Clarissa Beatriz Palatnik de Souza
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Palavras-chave em Português: Leishmaniose; vacinas; antígenos
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/UCSD-8HELLF

Este trabalho baseou-se na idéia de se isolar antígenos de vacinas contra Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), armazenadas por longos períodos, (Leishvacin). Estas vacinas apresentam alto grau de degradação em função dos anos de armazenamento, mas são ainda capazes de induzir proteção contra a leishmaniose tegumentar em humanos, apesar de terem sido estocadas por períodos acima de cinco anos.Antígenos foram isolados de amostras de vacina polivalente, constituídas por cinco diferentes linhagens dermotrópicas de Leishmania, e de amostras de vacina monovalente constituída pela linhagem do parasito Leishmania amazonensis, por dois diferentes métodos de fracionamento (diálise e cromatografia). Pelo método de diálise foram isolados antígenos de quatro das cinco linhagens de Leishmania presentes na vacina polivalente (Leishmania (L) amazonensis, Leishmania (L) mexicana, e duas linhagens de Leishmania major-like). Estes antígenos são capazes de discriminar soros de indivíduos americanos e de cães infectados com a forma visceral da doença (LVA) de soros de indivíduos infectados com a forma tegumentar da doença (LTA), ou de indivíduos saudáveis. Estes antígenos foram também isolados de amostras de vacina fresca constituída por L amazonensis, indicando que sua formação é independente do tempo de estocagem das vacinas. Tais antígenos são formados por fenômenos complexos de agregação molecular de pequenas moléculas, apresentando peso molecular na faixa de 106 KDa, tendo sido obtidos tanto no dialisado das vacinas quanto na fração não dialisada.Por cromatografias de exclusão molecular foram isolados antígenos da fração solúvel da vacina polivalente (antígeno PI) e de vacina monovalente da linhagem Leishmania (L) amazonensis, cepa PH8 do parasito (antígeno P8). Assim como os antígenos obtidos no dialisado e na fração não dialisável destas vacinas, PI e P8 são também antígenos formados por fenômenos de agregação molecular de pequenas moléculas, independente do tempo de armazenamento das vacinas. Estes antígenos são também especificamente reconhecidos pelo soro de humanos e de cães com LVA, mas não pelo soro de indivíduos normais ou infectados com outras formas da leishmaniose ou com outras doenças. Não há reatividade cruzada destes antígenos com soro de indivíduos com doença de Chagas, seja em ensaios de Elisa ou em ensaios de western blot. PI e P8 são moléculas de peso molecular na faixa de 106 KDa, assim como os antígenos obtidos pelo fracionamento da vacina por métodos de diálise.Análises dos antígenos PI e P8 por métodos químicos e físicos indicam que estes antígenos não apresentam material de natureza protéica ou ácidos nucléicos na sua composição. A análise direta por métodos quantitativos confirmam a ausência de proteínas na composição dos antígenos. Por outro lado, tanto a análise por métodos químicos quanto a análise por métodos de análise quantitativos confirmam que PI e P8 são antígenos de carboidrato. PI e P8 são sensíveis ao tratamento por agentes químicos como o dodecil sulfato de sódio (SDS), 2-mercaptoetanol e o ácido periódico, sendo que os dois últimos agentes são capazes de abolir por completo a reatividade destes antígenos com o soro de humanos e de cães com LVA. Nossos estudos indicam que os três reagentes agem na estrutura destes antígenos dissociando-os em seus componentes de menor peso molecular, porém a desagregação ocorre por mecanismos distintos de acordo com o reagente utilizado. Os resultados indicam que o SDS age desestabilizando interações iônicas na estrutura dos antígenos, enquanto o 2-mercaptoetanol age, provavelmente, rompendo ligações químicas intra ou intermoleculares nos antígenos. Os resultados também indicam que o 2-mercaptoetanol não promove o rompimento de ligações glicosídicas, sendo que a perda da capacidade dos antígenos de reagirem com os soros de indivíduos com LVA envolve alterações na conformação dos antígenos, sendo estes antígenos PI e P8 provavelmente formados por epitopos conformacionais.Análises em eletroforese e por cromatografia de fase reversa indicam que PI e P8 são formados pela agregação de moléculas de peso molecular (PM) em torno de 2,50 KDa. Os resultados obtidos por fase reversa descartam a presença de ácidos graxos ou de lipídeos na composição química dos antígenos. Finalmente, análises por métodos de cromatografia em camada delgada confirmam que PI e P8 são antígenos de carboidrato. PI e P8 são constituídos por glicose, galactose, manose e, possivelmente, apresentam na sua composição derivados de açúcares como fosfoaçúcares, aminoaçúcares e sulfoaçúcares.Os resultados aqui apresentados indicam que as vacinas, objeto deste estudo, sofrem alterações consideráveis em sua composição química sendo as mais relevantes: i) o alto grau de degradação de moléculas gerando moléculas de menor PM, ii) formação de antígenos de alto PM por fenômenos de agregação molecular, ii) o reconhecimento destes antígenos por soro de indivíduos com LVA mas não por soro de indivíduos com LTA, iv) o fato destes antígenos agregados serem essencialmente constituídos de carboidrato.